李 良 周 艷 滕 飛 郭增旺 田 甜 王中江

(東北農(nóng)業(yè)大學食品學院， 哈爾濱 150030)

0 引言

大豆分離蛋白(Soy protein isolate, SPI)具有乳化性、起泡性和凝膠性等功能特性[1]。其功能特性在酸性和堿性條件、高溫及有機溶劑等逆環(huán)境中易遭受破壞，限制了在食品工業(yè)中的應用[2]。美拉德反應是一種非酶、天然、無毒的蛋白質(zhì)或多糖修飾方法，被認為是改善蛋白質(zhì)或氨基酸乳化和抗氧化性能的優(yōu)異方法[3]，但也存在效率低、時間長、能耗高、反應過程難以控制等缺陷。故探索如何提高美拉德反應效率以及控制反應進程成為近年來國內(nèi)外的研究熱點。

射流空化作為一種新型強化手段，具有空化場均勻、操作簡便、效率高等特點，基于液體中的空化泡潰滅時產(chǎn)生的極端熱、高壓、強烈的沖擊波以及高時速的微射流將產(chǎn)生機械效應、自由基效應和熱效應[4]。文獻[5]發(fā)現(xiàn)，動態(tài)高壓微射流(Dynamic high pressure microfluidization, DHPM)與糖基化結合導致β-乳球蛋白解折疊和聚集，增加了變性溫度；文獻[6]認為，DHPM預處理誘導牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)結構去折疊，可提高BSA美拉德反應程度；文獻[7]發(fā)現(xiàn)，DHPM改變了α-乳白蛋白的三級結構，促進了美拉德反應，提高了美拉德反應產(chǎn)物的乳化性能和抗氧化活性。但目前有關射流空化對美拉德反應進程及產(chǎn)物功能特性影響的研究較少。

本文研究射流空化處理對SPI-葡聚糖美拉德反應進程的影響，以及壓力對產(chǎn)物結構和功能特性的影響，為改善蛋白質(zhì)功能特性提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白(純度90.21%以上，灰分質(zhì)量分數(shù)5.7%，脂肪質(zhì)量分數(shù)0.95%，粗纖維質(zhì)量分數(shù)0.87%)，山東禹王實業(yè)(集團)有限公司；葡聚糖(分子量70 ku)，分析純，上海源葉生物科技有限公司；非轉(zhuǎn)基因大豆色拉油，食用級，九三糧油工業(yè)集團有限公司；鄰苯二甲醛(OPA)，北京索萊寶科技有限公司；其他所需試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

M-700型微射流均質(zhì)機，美國Microfluidics公司；UV-2600型紫外-可見分光光度計，日本島津公司；JJ-1型恒溫磁力攪拌器，常州國華電器有限公司；電子分析天平(精度0.000 1 g)，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；RF-5301PC型熒光分光光度計，日本Hitachi公司；PHSJ-4A 型實驗室pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1SPI射流空化處理

將SPI樣品溶于0.2 mol/L、pH值7.0的磷酸鹽緩沖液，室溫(20℃)下磁力攪拌2.5 h，調(diào)節(jié)大豆分離蛋白質(zhì)量分數(shù)至4%。取500 mL SPI溶液室溫下進行射流空化處理，處理壓力分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0 MPa，每次10 min，均質(zhì)處理3次，處理后樣品于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2SPI-葡聚糖結合物制備

處理后的SPI溶液與1%葡聚糖(70 ku)溶液(由0.2 mol/L、pH值8.0磷酸鹽緩沖溶液配置)，按照體積比1∶1的比例混合，在室溫磁力攪拌2 h，確保完全水合蛋白和葡聚糖，水合溶液放入冰箱中預凍，然后經(jīng)真空冷凍干燥機進行冷凍干燥[8]。在一定的相對濕度(79%)、溫度(60℃)條件下，密閉容器中干法美拉德反應48 h得SPI-葡聚糖樣品，研磨粉碎后儲存在-20℃?zhèn)溆肹9]。

1.3.3褐變程度

SPI-葡聚糖樣品溶于0.2 mol/L、pH值7.0磷酸鹽緩沖液，樣品溶液質(zhì)量濃度10 mg/mL，磁力攪拌20 min，以0.2 mol/L、pH值7.0磷酸鹽緩沖液作空白，紫外分光光度計420 nm測定其吸光度A420，數(shù)值越小，表示褐變指數(shù)越小[10]。

1.3.4中間產(chǎn)物

SPI-葡聚糖樣品溶于0.2 mol/L、pH值7.0磷酸鹽緩沖液，樣品溶液質(zhì)量濃度5 mg/mL，磁力攪拌20 min，紫外分光光度計測定294 nm下吸光度A294。數(shù)值越大，表示反應生成的中間產(chǎn)物含量越多[11]。

1.3.5接枝度

按照上述方法配置2 mg/mL SPI-葡聚糖樣品溶液，加入4 mL鄰苯二甲醛(OPA)試劑，充分混勻后，35℃水浴加熱2 min，紫外分光光度計測量其340 nm處的吸光度。以200 μL(0.2 mol/L、pH值7.0)磷酸鹽緩沖液作空白。將80 mg OPA(溶解在2.0 mL 95%乙醇中)，50 mL 0.1 mol/L四硼酸鈉緩沖液(pH值9.5)，5.0 mL 20%SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液和0.2 mL 2-巰基乙醇混合、定容至100 mL配制OPA試劑[12]。接枝度計算公式為

(1)

式中At——糖化蛋白溶液340 nm處吸光度

A0——蛋白溶液在相同反應條件340 nm處吸光度

1.3.6聚丙烯酰胺凝膠電泳

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)測定SPI蛋白和SPI-葡聚糖美拉德反應產(chǎn)物的分子質(zhì)量。電泳用分離膠和濃縮膠的條件是：分離膠質(zhì)量分數(shù)10%，濃縮膠質(zhì)量分數(shù)5%，樣品質(zhì)量濃度5 mg/mL，上樣量體積10 μL，電泳電壓分三段式(50、80、120 V，每隔30 min切換一次電壓)，當染料前沿距橡膠框底邊約1 cm時，停止電泳?？捡R斯亮藍R-250染色30～60 min，脫色。

1.3.7樣品熒光性

SPI-葡聚糖樣品2.5 mg/mL(0.2 mol/L磷酸鹽、pH值7.0)，室溫下溶解，避光保存。激發(fā)波長為290 nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫為5 nm，并且發(fā)射光譜在200～500 nm記錄熒光光譜，具有240 nm/min的恒定掃描速度[13]。

1.3.8紫外光譜

以磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L、pH值7.0)作空白對照，SPI-葡聚糖溶液的蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL(0.2 mol/L磷酸鹽、pH值7.0)，在紫外分光光度計中測定樣品200～400 nm范圍紫外吸收圖譜[14]。

1.3.9表面疏水性

取4 mL SPI-葡聚糖樣品溶液(2.5 mg/mL)加入20 μL ANS(8-苯胺萘磺-1-1酸鹽) 儲備溶液(8.0 mmol/L)，用0.01 mol/L、pH值7.4的Tris-HCl緩沖液將蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度稀釋至0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL。當λex=390 nm (2.5 nm狹縫寬度)時，測量470 nm處熒光值F。對蛋白質(zhì)量濃度線性擬合，初始斜率H0表示表面疏水性指數(shù)[15]。

1.3.10乳化活性和乳化穩(wěn)定性

將SPI-葡聚糖樣品溶于0.2 mol/L、pH值7.0磷酸鹽緩沖液中，使其質(zhì)量濃度為0.001 g/mL，取30 mL糖化蛋白樣品中加入10 mL的大豆油配制混合溶液，高速分散機以10 000 r/min將混合溶液高速剪切2 min，重復3次。從新鮮制備的乳液樣品的底部取出50 μL并立即分散到5 mL 0.1%SDS 溶液中，混合均勻。分別在0 min和10 min時測定其在500 nm處吸光度A00和A10，以0.1% SDS 溶液作對照[16]。乳化活性指數(shù)(EAI)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI)計算公式為

(2)

(3)

式中EAI——乳化活性指數(shù)，m2/g

ESI——乳化穩(wěn)定性指數(shù)，min

c——乳液形成前溶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，g/mL

θ——乳狀液中油相體積分數(shù)，取0.25

V——稀釋倍數(shù)

1.4 數(shù)據(jù)處理

本試驗均重復3次，測定值為平均值±標準偏差，所得試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件的One Way ANOVA進行顯著性分析(P<0.05)，Origin 9.0軟件制圖。

2 結果與討論

2.1 褐變程度及中間產(chǎn)物

圖1 射流空化壓力對褐變程度及中間產(chǎn)物含量的影響Fig.1 Effect of jet cavitation powers on browning intensity and A294

美拉德反應可分為初級、中級和高級3個階段，反應過程通常伴隨褐變現(xiàn)象，同時高級反應階段產(chǎn)生一類統(tǒng)稱為類黑精的含氮棕色聚合物。隨美拉德反應的持續(xù)進行，反應體系的顏色變得越來越深，因此蛋白質(zhì)的美拉德反應進程可通過測定反應體系在420 nm下的吸光度變化反映出來，從而得知美拉德反應體系的褐變程度[17]。一般吸光度越大，反應越快，中間產(chǎn)物越多。射流空化壓力對褐變程度及中間產(chǎn)物含量的影響如圖1所示，隨射流空化壓力逐漸增大，反應體系的褐變程度表現(xiàn)出先增大后降低的趨勢。當射流空化壓力為1.5 MPa時，A420達到0.55，與對照樣品(0.47)相比提高了17.02%，表明射流空化處理能顯著提高美拉德反應的速率，增加中間產(chǎn)物的含量(P<0.05)。射流空化處理時空化泡潰滅產(chǎn)生的機械效應及較高的沖擊波和微射流可能會導致SPI分子結構伸展，暴露出更多的反應位點，有助于提高蛋白的活性，從而加快美拉德反應[18]。當射流空化壓力繼續(xù)增大到2.0 MPa時，A420下降到0.44。射流空化壓力過大會導致伸展的蛋白分子連接、聚集，不利于美拉德反應的進行[17]。綜合褐變程度和中間產(chǎn)物的結果可知，當射流空化壓力1.5 MPa時美拉德反應速率較快，中間產(chǎn)物含量多，反應停留在中間階段，有利于產(chǎn)物乳化性等功能性質(zhì)提高。

2.2 接枝度

美拉德反應主要是蛋白游離氨基和多糖羧基之間的反應，游離氨基數(shù)目越少，說明參與反應的氨基越多，反應進行程度也就越高，因此可通過利用鄰苯二甲醛(OPA)法游離氨基數(shù)目計算接枝度表示反應進行程度。由圖2可知，射流空化處理可顯著提高美拉德反應速率，這可能是由于液體中的空化泡潰滅時產(chǎn)生的空穴及機械效應，增加了氣泡周圍的壓強，導致蛋白分子結構伸展，肽鍵斷裂，蛋白溶出率增加，增加了反應體系中可用游離氨基的含量，增大了其與糖碰撞的可能性，從而促進SPI與葡聚糖發(fā)生美拉德反應[19]。文獻[20]研究發(fā)現(xiàn)高強度聲波產(chǎn)生的機械效應及熱效應能夠改變蛋白質(zhì)分子的空間構象及結構，使得包埋在結構內(nèi)部的親水性氨基酸殘基暴露出來。在射流空化時間一定的條件下，SPI-葡聚糖樣品的接枝度隨著射流空化壓力呈先增加后減小的趨勢，當壓力為1.5 MPa時，接枝度從32.54%增加到了57.89%。但隨著射流空化壓力繼續(xù)增大到2.0 MPa時，接枝度下降到42.68%，過大的空化壓力導致蛋白變性嚴重，發(fā)生自身聚集，阻礙了美拉德反應的進程。

圖2 射流空化壓力對接枝度的影響Fig.2 Effect of jet cavitation powers on degree of grafting

2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳

為研究蛋白的成分變化，射流空化處理SPI-葡聚糖產(chǎn)物的SDS-PAGE圖譜如圖3(條帶M表示標準蛋白分子；條帶1～5表示不同射流空化壓力(0、0.5、1.0、1.5、2.0 MPa))所示，與未射流空化處理的SPI-葡聚糖產(chǎn)物(條帶1)相比，隨射流空化壓力(0.5～1.5 MPa)增加，低分子量(20～25 ku附近)條帶逐漸變淺，表明射流空化促進SPI與葡聚糖的接枝反應生成了其他物質(zhì)。根據(jù)SDS-PAGE遷移機制，推斷SPI-葡聚糖產(chǎn)物可能通過共價鍵結合[21]。射流空化處理的空穴和機械效應使SPI分子解折疊，暴露出更多的活性基團，有利于蛋白和多糖之間的結合，促進SPI-葡聚糖美拉德反應進程[19]。射流空化壓力繼續(xù)增加至2.0 MPa時，射流空化抑制了SPI與葡聚糖的美拉德反應。這主要是由于射流空化產(chǎn)生的極端熱和高壓作用導致蛋白質(zhì)發(fā)生變性聚集，結構折疊，阻礙了美拉德反應進程。

圖3 不同射流空化壓力對SPI-葡聚糖美拉德反應產(chǎn)物分子量的影響Fig.3 Effect of different jet cavitation powers on molecular weight of Maillard reaction products (SPI-dextran)

2.4 樣品熒光性分析

熒光光譜分析是研究蛋白及肽空間結構(三級結構)的有力手段，也可以用來研究美拉德反應產(chǎn)物的結構。熒光化合物形成與美拉德反應有關，Amadori化合物與蛋白質(zhì)或游離氨基產(chǎn)生交聯(lián)，美拉德反應后期階段產(chǎn)生熒光聚合物，其熒光性可作為美拉德反應的標志[22]。美拉德反應過程中生成的具有熒光特性的產(chǎn)物典型光譜特征是：激發(fā)波長是340～370 nm，發(fā)射波長是420～440 nm。圖4為不同射流空化壓力對SPI-葡聚糖樣品熒光性的影響。與天然SPI相比，經(jīng)射流空化處理后，SPI的熒光強度升高。這可能是因為射流空化的沖擊波及高時速的微射流產(chǎn)生的機械效應破壞了SPI的空間結構，導致分子內(nèi)部的Trp更多地暴露在極性環(huán)境中，增加了SPI的熒光強度[23]。隨空化壓力增加，當壓力超過1.5 MPa時SPI的熒光強度降低。當空化壓力過大時，射流空化產(chǎn)生的高壓和熱效應導致蛋白分子變性嚴重，蛋白發(fā)生折疊，疏水性被殘基包埋，引起熒光猝滅[17]。文獻[24]提出空化可能通過破壞蛋白質(zhì)的四級和三級結構促進蛋白質(zhì)變性。經(jīng)葡聚糖美拉德反應后，SPI-葡聚糖反應產(chǎn)物的熒光強度顯著降低，可能是由于SPI與葡聚糖的結合對部分色氨酸起到了屏蔽作用[25]，且隨空化壓力的增大，熒光強度先增后減，1.5 MPa時SPI-葡聚糖的熒光強度達最低，可能是當空化壓力為1.5 MPa時SPI-葡聚糖反應體系的美拉德反應程度最大，結合的葡聚糖含量最多，具有更強的屏蔽效應。

圖4 射流空化壓力對SPI-葡聚糖樣品熒光掃描光譜的影響Fig.4 Effect of jet cavitation powers on fluorescence spectra of SPI and SPI-dextran

2.5 紫外光譜分析

蛋白質(zhì)產(chǎn)生紫外吸收主要是由于蛋白的發(fā)色基團對紫外光的吸收作用，發(fā)色基團包括色氨酸和酪氨酸殘基側(cè)鏈基團，根據(jù)對紫外光譜吸收的不同，可以推斷蛋白質(zhì)分子構象的變化[26]。不同射流空化壓力對SPI-葡聚糖產(chǎn)物的紫外吸收光譜如圖5所示，紫外吸收峰的最大值隨空化壓力的增加而增加。這說明SPI分子中的氨基酸殘基因空化處理暴露在蛋白分子的表面，發(fā)色基團所處的環(huán)境由非極性向極性變化，促使蛋白多肽鏈局部展開[27]。在射流空化壓力為1.5 MPa時紫外光譜的吸收峰取得最大值，之后呈現(xiàn)減小的趨勢，這與2.4節(jié)熒光光譜的變化趨勢一致。與對照SPI-葡聚糖反應產(chǎn)物相比，射流空化處理的SPI與葡聚糖美拉德反應產(chǎn)物的紫外吸收峰顯著降低，可能是由于射流空化處理加快了SPI與葡聚糖的美拉德反應進程，蛋白質(zhì)發(fā)生折疊自身聚集，使得蛋白分子中更多的疏水性殘基再次埋到分子結構內(nèi)部[28]。

圖5 射流空化壓力對SPI及SPI-葡聚糖樣品紫外光譜的影響Fig.5 Effect of jet cavitation powers on UV-Vis spectra of SPI and SPI-dextran

2.6 表面疏水性分析

圖6為SPI的表面疏水性指數(shù)，與天然SPI相比，經(jīng)射流空化處理后SPI的H0顯著增大(P<0.05)。這可能是由于空化處理的高壓力改變了SPI構象，導致內(nèi)部疏水性基團部分暴露，H0增大。但當射流空化壓力超過1.5 MPa處理后H0有所下降，當疏水基團暴露較多時，其會通過疏水作用重新聚合[7]。空化處理的SPI發(fā)生美拉德反應后，較單獨空化處理的SPI，SPI-葡聚糖反應產(chǎn)物的H0顯著降低(P<0.05)，且隨空化壓力逐漸增加H0呈現(xiàn)出先降低后增加的趨勢(P<0.05)。當空化壓力達到1.5 MPa，SPI-葡聚糖反應產(chǎn)物的H0達到最小值(17.29)，與未進行射流空化處理的SPI-葡聚糖反應產(chǎn)物的H0相比減小了41.29%。這可能是空化處理使蛋白質(zhì)分子結構伸展，促進SPI與葡聚糖發(fā)生美拉德反應時，使更多的葡聚糖結合到SPI分子上，導致親水基團增多[29]。隨射流空化壓力繼續(xù)增大SPI-葡聚糖反應產(chǎn)物的H0增大，這與過大的空化壓力使蛋白分子聚集，減小了美拉德反應速率有關。

圖6 射流空化壓力對SPI及SPI-葡聚糖樣品表面疏水性的影響Fig.6 Effect of jet cavitation powers on surface hydrophobicity of SPI and SPI-dextran

2.7 乳化特性分析

圖7 射流空化壓力對SPI及SPI-葡聚糖樣品乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of jet cavitation powers on EAI and ESI of SPI and SPI-dextran

乳化活性指能夠參與并形成乳濁液的能力；乳化穩(wěn)定性指在一定時間里，蛋白質(zhì)能夠維持乳化狀態(tài)一直不變，既沒有出現(xiàn)油相與水相分層的變化，也沒有發(fā)生絮凝現(xiàn)象的能力，即能顯著地降低油、水或空氣、水的界面張力[30]。射流空化壓力對SPI及SPI-葡聚糖反應產(chǎn)物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響如圖7所示，射流空化處理可顯著增加SPI及SPI-葡聚糖反應產(chǎn)物的乳化特性，且與單獨射流空化處理相比，射流空化協(xié)同美拉德反應顯著增加了SPI的乳化活性和乳化穩(wěn)定性(P<0.05)。與對照相比，當射流空化壓力為1.5 MPa時，SPI的乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別增加了26.42%和30.13%。這可能是由于射流空化處理時，液體中空化泡潰滅時產(chǎn)生的強烈的沖擊波及高時速的微射流產(chǎn)生空穴和機械效應改變了蛋白質(zhì)的空間結構，使得極性側(cè)鏈的水合作用增強，同時使包埋在分子內(nèi)部的疏水性基團暴露出來，提高了其親水性和親油性，兩者達到較好的平衡，乳化性增強[29]。當射流空化處理壓力為1.5 MPa時，SPI與葡聚糖美拉德反應產(chǎn)物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性與對照(未射流空化處理SPI與葡聚糖美拉德反應產(chǎn)物)相比分別提高了40.61%和48.46%。美拉德反應的理想產(chǎn)物應該是蛋白的一部分疏水基團與多糖發(fā)生共價結合增加了復合物的親水性，同時保留足夠的疏水基團來維持產(chǎn)物的表面活性。射流空化處理使SPI分子結構伸展，有利于更多的葡聚糖結合到SPI分子側(cè)鏈，其較強的親水性使得SPI的親水基團增多，親水性增大，同時多糖鏈帶來的空間位阻抑制了油相的聚集，因此含有許多支鏈基團的大分子SPI-葡聚糖美拉德反應產(chǎn)物更容易在油/水界面上分散排列，使得蛋白界面不會輕易聚集到一起，從而提高了兩相界面之間的蛋白膜穩(wěn)定性，使得油滴之間不易聚合，形成緊密的穩(wěn)定層，改善了其乳化活性和乳化穩(wěn)定性[31]。但當射流空化壓力超過1.5 MPa時，SPI及SPI-葡聚糖反應產(chǎn)物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性呈現(xiàn)出下降的趨勢。這主要是由于伸展的SPI分子通過氫鍵和二硫鍵等作用力重新聚合到一起，表面疏水性及水-油界面平衡力減弱，同時蛋白分子聚集導致美拉德反應速率降低，使得乳化活性和乳化穩(wěn)定性下降[17]。這與2.2節(jié)中SPI-葡聚糖反應產(chǎn)物的接枝度變化趨勢相一致。

3 結束語

以大豆分離蛋白和葡聚糖為原料，研究了射流空化壓力對SPI的美拉德反應進程的影響，并進一步研究了射流空化壓力對結合物結構及乳化特性的影響。研究顯示：射流空化壓力可增加美拉德反應的褐變程度、中間產(chǎn)物含量及接枝度，且當空化壓力為1.5 MPa時，SPI與葡聚糖美拉德反應速度最快；射流空化處理可顯著改善SPI的空間結構，蛋白分子伸展，使得包埋在分子內(nèi)部的疏水性基團暴露出來，促進了美拉德反應進程；射流空化處理SPI-葡聚糖美拉德反應產(chǎn)物乳化特性優(yōu)于單一的美拉德反應改性。本研究可為射流空化提高美拉德反應效率以及控制反應進程提供理論指導。