李國(guó)良 侯俊財(cái)

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院， 大慶 163319; 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030; 3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 哈爾濱 150030)

0 引言

大豆及其新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)越來(lái)越引起研究者的關(guān)注[1]。大豆蛋白作為一種優(yōu)秀的膳食蛋白，被我國(guó)等亞洲國(guó)家視為最重要的可食用蛋白來(lái)源之一[2-3]。大豆蛋白中包含人體所需要的8種必需氨基酸，大豆蛋白消化率校正氨基酸評(píng)分為1.0[4]。大豆肽通過(guò)蛋白酶水解獲得，與傳統(tǒng)的大豆蛋白相比，大豆肽具有分子量小、容易消化吸收、無(wú)豆腥味等優(yōu)點(diǎn)[5-6]。除了具有良好的理化特性外，大豆肽還可以提供人體所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)具有調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能、預(yù)防骨質(zhì)疏松、降低心血管疾病和高血壓的風(fēng)險(xiǎn)等保健功效[7-9]。

鈣元素是人體生長(zhǎng)發(fā)育的重要元素之一，約占人體質(zhì)量的1.5%～2%[10-11]。人體牙齒和骨骼中的鈣約占鈣總量的99%，其余1%的鈣位于人體軟組織內(nèi)和血液中[12]。人類日常飲食中若缺乏鈣，則會(huì)增加多種疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[13]。螯合是指配位體與金屬離子的一種特殊類型的絡(luò)合，螯合物是指一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)與一個(gè)金屬離子的配位反應(yīng)所形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)[14-15]。大豆肽-鈣螯合物是由可溶性的鈣離子與大豆肽按一定物質(zhì)的量比以共價(jià)鍵結(jié)合而成，從結(jié)構(gòu)的角度可以定義為：氨基酸的氨基端和羧基端與金屬鈣離子按一定的配比形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)產(chǎn)物[16]。

大豆脫脂豆粕是大豆提油后的副產(chǎn)物，其中的粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)30%～50%，然而其利用率卻較低，多用作動(dòng)物飼料[17]。豆粕的酶水解能夠有效改善其功能特性，并拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域。大豆肽-鈣螯合物是將鈣元素與大豆肽結(jié)合起來(lái)制成的新一代補(bǔ)鈣營(yíng)養(yǎng)性食品，可同時(shí)補(bǔ)充給人體所必需的鈣元素和氮源，具有鈣元素的利用率高、溶解性強(qiáng)和容易被人體吸收等優(yōu)點(diǎn)[18]。文獻(xiàn)[19]利用堿性蛋白酶進(jìn)行大豆分離蛋白的酶解以及類蛋白反應(yīng)修飾，并在醇-水介質(zhì)中對(duì)其進(jìn)行類蛋白反應(yīng)修飾。文獻(xiàn)[20]研究了酶解時(shí)間以及酸法脫酰胺改性對(duì)于脫植酸大豆分離蛋白肽鈣離子螯合能力的影響，并對(duì)鈣螯合物的結(jié)構(gòu)特性和營(yíng)養(yǎng)特性進(jìn)行了分析。

本文以國(guó)產(chǎn)大豆脫脂豆粕為主要原料，研究肽鈣比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和pH值對(duì)鈣結(jié)合量的影響，經(jīng)過(guò)單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，篩選大豆肽-鈣螯合物最佳制備工藝，旨在為新型大豆?fàn)I養(yǎng)保健產(chǎn)品及合成新型補(bǔ)鈣制劑的研發(fā)提供新方法、新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆脫脂豆粕來(lái)自哈高科大豆食品有限責(zé)任公司；堿性蛋白酶來(lái)自諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司；酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、鹽酸、硼酸、無(wú)水氯化鈣、乙醇胺、鄰甲酚酞、8-羥基喹啉、鄰苯二甲醛、β-巰基乙醇、硫酸銅等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀，上海伍豐科學(xué)儀器有限公司；ALC-310.3型電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；pHS-3C型精密pH計(jì)，塞多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；LD4-2A型離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；電動(dòng)攪拌器，金壇市醫(yī)療儀器廠；DHG-9240型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司；電磁爐，廣東容聲電器股份有限公司；721型分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；游標(biāo)卡尺，上海量具刃具廠有限公司；S-3400N型掃描電子顯微鏡，日立掃描電鏡公司。

1.3 加工工藝及要點(diǎn)

大豆鈣肽產(chǎn)品的加工工藝為：大豆蛋白→大豆蛋白液→加入蛋白酶，酶解→滅酶→離心取上清液→冷凍干燥→取一定量加入氯化鈣→螯合→冷凍干燥→大豆鈣肽產(chǎn)品。其工藝要點(diǎn)如下：

(1)大豆蛋白液制備：取大豆蛋白溶于水中，制成蛋白溶液，可加熱加速其溶解。加入1 mol/L的氫氧化鈉將蛋白溶液pH值調(diào)節(jié)至7.0～8.0。

(2)酶解：向蛋白溶液中準(zhǔn)確加入一定比例的堿性蛋白酶，將溶液調(diào)節(jié)至該蛋白酶最適條件(pH值8.0，最適溫度50℃)進(jìn)行水解，pH值保持恒定，偏差在±0.01范圍內(nèi)。

(3)滅酶：待反應(yīng)結(jié)束后，溶液迅速升溫至90℃，滅酶10 min。

(4)離心、冷凍干燥：滅酶后冷卻至室溫(20℃)，pH值調(diào)到7.0，離心(4 000 r/min，20 min)，收集上清液，即大豆肽溶液，冷凍干燥。

(5)螯合：50 g/L的肽溶液與0.04 mol/L氯化鈣按一定肽鈣比(肽溶液與氯化鈣溶液質(zhì)量比)進(jìn)行混合，調(diào)節(jié)pH值，充分混合后，在一定溫度下反應(yīng)一段時(shí)間。

(6)成品：螯合后進(jìn)行冷凍干燥，即得大豆肽-鈣成品。

1.4 檢測(cè)方法

鈣結(jié)合量的測(cè)定采用鄰甲酚酞比色法；溶解性的測(cè)定采用雙縮脲法。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1單因素試驗(yàn)

(1)肽鈣比

選擇1、2、3、4、5、6共6個(gè)肽鈣比，固定pH值6.0，反應(yīng)時(shí)間30 min，反應(yīng)溫度35℃的條件下，對(duì)鈣結(jié)合量進(jìn)行測(cè)定，以研究肽鈣比對(duì)鈣結(jié)合量的影響。

(2)反應(yīng)溫度

選擇30、35、40、45、50℃共5個(gè)溫度梯度，固定肽鈣比為2，pH值7.0，反應(yīng)時(shí)間為45 min的條件下，對(duì)鈣結(jié)合量進(jìn)行測(cè)定，以研究反應(yīng)溫度對(duì)鈣結(jié)合量的影響。

(3)反應(yīng)時(shí)間

選擇25、30、35、40、45、50 min共6個(gè)時(shí)間梯度，固定肽鈣比為2，pH值7.0，反應(yīng)溫度35℃的條件下，對(duì)鈣結(jié)合量進(jìn)行測(cè)定，以研究反應(yīng)時(shí)間對(duì)鈣結(jié)合量的影響。

(4)pH值

選擇4.0、5.0、6.0、7.0、8.0共5個(gè)pH值，固定肽鈣比為2，反應(yīng)時(shí)間30 min，反應(yīng)溫度35℃的條件下，對(duì)鈣結(jié)合量進(jìn)行測(cè)定，以研究pH值對(duì)鈣結(jié)合量的影響。

1.5.2大豆肽-鈣合成工藝優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)，選取四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)對(duì)大豆鈣肽合成工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1.6 大豆肽-鈣螯合物的分子量分布測(cè)定

利用高效液相色譜法對(duì)大豆肽-鈣螯合物的分子量分布情況進(jìn)行表征[18]。采用乙腈-水-三氟乙酸(體積比45∶55∶0.1)作為流動(dòng)相，用于溶解大豆肽-鈣螯合物樣品，控制最終質(zhì)量濃度為5 mg/mL，通過(guò)濾膜過(guò)濾和超聲后進(jìn)樣。試驗(yàn)參數(shù)設(shè)置：進(jìn)樣量為20 μL，流速為0.5 mL/min，柱溫為30℃，檢測(cè)器波長(zhǎng)為214 nm，進(jìn)樣時(shí)間為35 min。

1.7 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行處理，并通過(guò)SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。采用Design-Expert 7.0軟件，根據(jù)Box-Benhnken中心組合原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和回歸分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

大豆分離蛋白在經(jīng)過(guò)堿性蛋白酶水解后，形成小分子量的大豆肽，這些大豆肽在一定條件下可與鈣離子結(jié)合，形成肽-鈣螯合物。但在螯合過(guò)程中有許多因素制約著螯合物中的鈣結(jié)合量[21]。因此，需要進(jìn)一步討論螯合工藝的最佳條件，確定最優(yōu)螯合條件，從而達(dá)到高含鈣量的目的。

2.1 螯合條件對(duì)鈣結(jié)合量的影響

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

鄰甲酚酞與鈣在pH值11.0±0.1的緩沖液中形成紫色絡(luò)合物，利用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，其最大吸收波長(zhǎng)為570 nm。用掩蔽劑(8-羥基喹啉)消除其他二價(jià)陽(yáng)離子的干擾。反復(fù)測(cè)定8次，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 鈣含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of calcium content

2.1.2肽鈣比對(duì)鈣結(jié)合量的影響

肽鈣比是螯合工藝的重要參數(shù)，對(duì)鈣結(jié)合量起著至關(guān)重要的作用。肽含量少，無(wú)法與鈣完全結(jié)合；肽含量過(guò)多，與鈣結(jié)合完仍有剩余，造成不必要的耗損[22]。在pH值6.0、反應(yīng)時(shí)間30 min、反應(yīng)溫度35℃的條件下，考察不同肽鈣比對(duì)鈣結(jié)合量的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 肽鈣比對(duì)鈣結(jié)合量的影響Fig.2 Effect of peptide calcium ratio on calcium-binding capacity

從圖2可以看出，當(dāng)肽鈣比為2時(shí)，鈣結(jié)合量達(dá)到最大值70.87 mg/g。繼續(xù)增加肽鈣比，鈣結(jié)合量越來(lái)越低。呈現(xiàn)這種變化趨勢(shì)主要是因?yàn)楫?dāng)肽鈣比為1時(shí)，肽含量少，無(wú)法與鈣完全結(jié)合；當(dāng)肽鈣比大于2時(shí)，與鈣完全結(jié)合后，肽仍有剩余，導(dǎo)致每克中鈣含量減少。因此，后續(xù)試驗(yàn)中選擇肽鈣比為2作為最適值。

2.1.3pH值對(duì)鈣結(jié)合量的影響

pH值是鈣結(jié)合量的重要影響因素之一。在大豆肽與鈣螯合反應(yīng)中，—COO—有至關(guān)重要的作用。Ca2+屬于硬酸，易與氨基酸中的羧基發(fā)生配位作用，但與氮原子的配位作用較弱。在酸性條件下，大豆肽會(huì)發(fā)生解離生成—COO—，使得與Ca2+結(jié)合的—COO—增加，在pH值大于6.5時(shí)，由于質(zhì)子化氨基的解離,可與Ca2+形成包括O、N配位原子的配合物，部分大豆肽與Ca2+通過(guò)吸附作用結(jié)合[23]，從而使得鈣結(jié)合量在pH值為7時(shí)達(dá)最大值。因在堿性條件下，OH—會(huì)與Ca2+反應(yīng)產(chǎn)生Ca(OH)2，影響大豆肽與鈣的螯合，因此，本試驗(yàn)不研究堿性條件下的螯合。

在肽鈣比為2，反應(yīng)時(shí)間30 min，反應(yīng)溫度35℃，分別在不同pH值的條件下進(jìn)行螯合，然后測(cè)定鈣結(jié)合量，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。通過(guò)此單因素試驗(yàn)可看出，在pH值為7.0時(shí)，鈣結(jié)合量達(dá)到最大值，因此，在后續(xù)試驗(yàn)中選擇pH 值7.0作為最佳參數(shù)。

圖3 pH值對(duì)鈣結(jié)合量的影響Fig.3 Effect of pH value on calcium-binding capacity

2.1.4反應(yīng)時(shí)間對(duì)鈣結(jié)合量的影響

在肽鈣比為2，控制pH值7.0，反應(yīng)溫度35℃的條件下，分別反應(yīng)25、30、35、40、45、50 min，然后測(cè)定鈣結(jié)合量，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)鈣結(jié)合量的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)鈣結(jié)合量的影響Fig.4 Effect of reaction time on calcium-binding capacity

由圖4可知，螯合反應(yīng)是需要一定反應(yīng)時(shí)間的，30 min前反應(yīng)較劇烈，30 min后變化趨于平穩(wěn)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為45 min時(shí)，鈣結(jié)合量達(dá)到最大值，即75.89 mg/g。大豆肽與Ca2+通過(guò)吸附作用結(jié)合，隨反應(yīng)進(jìn)行著動(dòng)態(tài)的吸附和解析的過(guò)程，當(dāng)45 min時(shí)整個(gè)過(guò)程達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，因此，后續(xù)試驗(yàn)選擇反應(yīng)時(shí)間45 min為最佳參數(shù)。

2.1.5反應(yīng)溫度對(duì)鈣結(jié)合量的影響

在肽鈣比為2，pH值7.0，反應(yīng)時(shí)間為45 min的條件下，選取反應(yīng)溫度為30、35、40、45、50℃進(jìn)行試驗(yàn)，然后測(cè)定鈣結(jié)合量，考察反應(yīng)溫度對(duì)鈣結(jié)合量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 反應(yīng)溫度對(duì)鈣結(jié)合量的影響Fig.5 Effect of reaction temperature on calcium-binding capacity

從圖5可看出，溫度對(duì)鈣結(jié)合量的影響也較明顯，在反應(yīng)溫度為40℃時(shí)，鈣結(jié)合量達(dá)到最大值，而高于40℃后鈣結(jié)合量明顯降低。由此可見(jiàn)，較高溫度對(duì)大豆肽與鈣結(jié)合是不利的。高溫可能會(huì)使水分不斷蒸發(fā)，部分氨基酸析出，螯合物分解或發(fā)生其它的反應(yīng)；合適的溫度有利于螯合向正方向發(fā)展，高于或低于這個(gè)溫度都不利于螯合物生成[24]。因此，選擇40℃為最佳反應(yīng)溫度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.6螯合工藝優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素所得結(jié)果，以肽鈣比、pH值、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度為響應(yīng)變量，以鈣結(jié)合量Y為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法中的中心組合設(shè)計(jì)進(jìn)行大豆鈣肽螯合最佳配比優(yōu)化，響應(yīng)面因素編碼見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素編碼Tab.1 Factors and codes of response surface design

試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2，表2中X1、X2、X3、X4分別表示肽鈣比、pH值、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度的編碼值。采用Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，得到4個(gè)因素與響應(yīng)值的模型回歸方程為

對(duì)建立模型進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，分析結(jié)果分別見(jiàn)表3、4；響應(yīng)面圖見(jiàn)圖6～11。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Experimental results of response surface

表3 方差分析Tab.3 Variance analysis of regression equation

由圖6～11可以看出，鈣結(jié)合量隨著肽鈣比、pH值、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度的增加均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，但增加和降低都較緩慢。從等高線形狀可以看出，各因素之間的交互作用均不顯著。

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Tab.4 Significance test for each coefficient in established regression model

注： ** 代表差異極顯著(P<0.01)；*代表差異顯著(P<0.05)。

圖6 肽鈣比和pH值對(duì)鈣結(jié)合量影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot for effect of peptide calcium ratio and pH value to calcium chloride on chelate ratio

圖7 肽鈣比和反應(yīng)時(shí)間對(duì)鈣結(jié)合量影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plot for effect of peptide calcium ratio and reaction time to calcium chloride on chelate ratio

圖8 肽鈣比和反應(yīng)溫度對(duì)鈣結(jié)合量影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface plot for effect of peptide calcium ratio and reaction temperature to calcium chloride on chelate ratio

圖9 pH值和反應(yīng)時(shí)間對(duì)鈣結(jié)合量影響的響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface plot for effect of pH value and reaction time to calcium chloride on chelate ratio

圖10 pH值和反應(yīng)溫度對(duì)鈣結(jié)合量影響的響應(yīng)面圖Fig.10 Response surface plot for effet of pH value and reaction temperature to calcium chloride on chelate ratio

圖11 反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度對(duì)鈣結(jié)合量影響的響應(yīng)面圖Fig.11 Response surface plot for effect of reaction time and reaction temperature to calcium chloride on chelate ratio

利用Design-Expert軟件計(jì)算得到大豆鈣肽螯合的最佳工藝參數(shù)為：肽鈣比1.62、pH值6.65、反應(yīng)時(shí)間43.64 min、反應(yīng)溫度38.43℃，鈣結(jié)合量的預(yù)測(cè)值為78.86 mg/g。從實(shí)際操作考慮其可行性，最佳工藝參數(shù)修改為：肽鈣比1.6、pH值6.6、反應(yīng)時(shí)間44 min、反應(yīng)溫度38℃。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次，最終得到鈣結(jié)合量平均值為78.73 mg/g，與理論預(yù)測(cè)值相差0.13 mg/g，說(shuō)明利用此優(yōu)化方法得到的大豆肽-鈣的制備工藝是可靠的。

2.2 大豆肽-鈣的溶解性

采用雙縮脲法測(cè)定大豆肽-鈣溶解性，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖12所示。雙縮脲法是基于銅離子與蛋白質(zhì)之間的反應(yīng)，溶解于堿性溶液中的硫酸銅加入蛋白質(zhì)溶液中，二價(jià)的銅被還原成一價(jià)銅并在堿性環(huán)境中與蛋白質(zhì)分子肽鍵中的氮形成絡(luò)合物，該絡(luò)合物呈紫紅色，可在540 nm處進(jìn)行檢測(cè)，吸光度與蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度成正比。

圖12 溶解性標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.12 Standard curve of solubility

標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，可用于溶解性計(jì)算。經(jīng)過(guò)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到大豆鈣肽溶解度最終平均值為98.59%。

2.3 大豆肽-鈣分子量分布

圖13所示為大豆肽-鈣螯合物的分子量分布情況，試驗(yàn)結(jié)果得出：分子量大于5 000 Da的大豆肽-鈣螯合物占總體的1.76%；3 000～5 000 Da的占總體的2.79%；2 000～3 000 Da的占總體的3.51%；1 000～2 000 Da的占總體的11.70%；500～1 000 Da的占總體的25.87%；180～500 Da的占總體的47.91%；小于180 Da的占總體的6.64%。由此可知分子量小于5 000 Da的占絕大多數(shù)，是總體的98.24%，其中180～500 Da占比最大。優(yōu)質(zhì)大豆肽的分子量應(yīng)小于1 000 Da，本試驗(yàn)所得分子量小于1 000 Da的大豆肽-鈣螯合物占總體的80.24%。曾有研究發(fā)現(xiàn)，分子量大于1 000 Da的肽段與小于1 000 Da的肽段相比，更易參與大豆肽-鈣螯合物的形成，這與本研究得到的結(jié)果有所不同，這可能是由于酶種類、效果及改性方式的差異所引起的[18]。此外，文獻(xiàn)[25]采用超濾發(fā)現(xiàn)分子量低于1 000 Da的蝦蛋白肽具有較高的鈣結(jié)合量，這說(shuō)明金屬離子與不同相對(duì)分子量肽的結(jié)合與肽的來(lái)源也密切相關(guān)。

圖13 分子量分布圖Fig.13 Molecular weight distribution map

3 結(jié)論

(1)通過(guò)試驗(yàn)確定了肽鈣比、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和pH值對(duì)鈣結(jié)合量的影響，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最佳螯合工藝為：鈣肽比1.6，pH值6.6，反應(yīng)溫度38℃，反應(yīng)時(shí)間為44 min，通過(guò)此工藝制備所得大豆肽-鈣螯合物中鈣結(jié)合量為78.73 mg/g。

(2)大豆肽-鈣螯合物的溶解度為98.59%。大豆鈣肽螯合物的分子量大于5 000 Da的占總體的1.76%，小于5 000 Da的占98.24%，小于1 000 Da的占80.24%，其中分子量180～500 Da占比最大。