李紅艷

（西藏民族大學(xué) 高原環(huán)境與疾病相關(guān)機(jī)理研究高校重點(diǎn)試驗(yàn)室，陜西 咸陽(yáng) 712082）

樺褐孔菌屬于銹草孔菌科 ( Hymnochaeaceae) 多孔菌目 ( Polyporales ) 層菌綱 ( Hymenomycetes ) 白樺茸 (Inonotus obliquus) 種的植物，又被叫作樺樹(shù)菇、西伯利亞靈芝等。16世紀(jì)以來(lái)，在東歐地區(qū)廣泛使用該真菌來(lái)治療疑難雜癥，例如癌癥、糖尿病、白血病以及心臟病等，并且均得到了較好的治療效果[1-2]，引起了大量研究學(xué)者的廣泛關(guān)注。近些年來(lái)，各個(gè)國(guó)家對(duì)樺褐孔菌展開(kāi)了研究，發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌可以降血壓、抗病毒、抗氧化以及抗腫瘤。但該種真菌屬于稀有真菌，2萬(wàn)棵樺樹(shù)中大約有一棵樹(shù)上會(huì)長(zhǎng)出樺褐孔菌，野生的樺褐孔菌非常昂貴。樺褐孔菌對(duì)人體心肌細(xì)胞凋亡的頡頏作用也備受人們關(guān)注，本文就此問(wèn)題展開(kāi)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

樺褐孔菌310株，延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院的真菌試驗(yàn)室對(duì)其進(jìn)行保存、分離處理。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基包括葡萄糖、黃豆粉和瓊脂[3]，分別為2%、1%和1%， KH2PO4、MgSO4·7H2O分別為0.10%和0.05%。液體培養(yǎng)基中則不需要添加瓊脂。

1.1.3 染色液

分別稱取固藍(lán)RR鹽50 mg、乙酸-2-萘酯25 mg、乙酸-1-萘酯25 mg，并在其中添加丙酮3 mL，對(duì)其進(jìn)行加熱，加熱到80℃～ 90℃固體溶解之后，再添加75 mL的染色緩沖液，最后獲得酯酶同工酶的染色液。

1.1.4 H9C2細(xì)胞

該細(xì)胞來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。培養(yǎng)基和胰酶來(lái)源于美國(guó)hyclone公司，胎牛血清來(lái)源于杭州四季青公司； 氯化鈷來(lái)源于美國(guó)Sigma司； 染色液來(lái)源于北京雷根生物技術(shù)有限公司； 雙染細(xì)胞凋亡測(cè)試劑來(lái)源于上海貝博生物； 其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純[4]。

1.2 試驗(yàn)儀器

試驗(yàn)儀器有：低溫高速離心機(jī)（Centrifuge 5417 R型），廣州立諾自動(dòng)化設(shè)備有限公司； 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（StepOne TM型），美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；可見(jiàn)分光光度計(jì)（722型），上海光學(xué)儀器廠； 酶標(biāo)儀（MR-96A型），上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司； 流式細(xì)胞儀（CytoFLEX型）， 貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)（中國(guó)）有限公司；激光共聚焦顯微鏡（TCS SP8），北京德利卡生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 人體外細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)

人體心肌細(xì)胞株復(fù)蘇之后，添加RPMI-1640培養(yǎng)基，放在5% CO2、37℃、飽和濕度的箱中，每隔3d進(jìn)行1次換液傳代。人體心肌細(xì)胞傳代到生長(zhǎng)旺盛階段時(shí)，再進(jìn)行試驗(yàn)之前的24 h內(nèi)換液，采用4 g·L-1臺(tái)盼藍(lán)染色3 min， 對(duì)人體心肌的活細(xì)胞進(jìn)行觀察，試驗(yàn)用到的細(xì)胞活性平均超過(guò)98%。

1.3.2 試驗(yàn)分組

將人體心肌細(xì)胞株進(jìn)行隨機(jī)分組，分成4組包括對(duì)照組和高、中和低3種劑量的樺褐孔菌提取物組，其中對(duì)照組中未添加藥物，而提取物組中的高、中、低劑量的濃度分別為 80 mg·L-1、40 mg·L-1、20 mg·L-1。其中每組中設(shè)置4個(gè)樣本。

1.3.3 藥物處理

選取對(duì)數(shù)人體心肌細(xì)胞并在其中添加0.25%的胰酶來(lái)消化，制成含有1×106個(gè)細(xì)胞的懸液，懸液的含量為3 mL，將其放置于T-25培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，貼壁之后每個(gè)瓶子中加入2.7 mL的培養(yǎng)液和樺褐孔菌提取物0.3 mL的培養(yǎng)液[4]，使其濃度始終保持在 80 mg·L-1、40 mg·L-1、20 mg·L-1。在對(duì)照組中添加相同體積的生理鹽水，并將該培養(yǎng)瓶放置在5% CO2、37℃飽和濕度的箱中，經(jīng)過(guò)48 h之后收取樺褐孔菌提取物，并將其分給對(duì)照組和劑量組細(xì)胞。

1.3.4 人體心肌細(xì)胞活力測(cè)定

對(duì)人體心肌細(xì)胞進(jìn)行接種，接種24 h之后，將其隨機(jī)分為6組： control組、CoCl2組和樺褐孔菌組（設(shè) 4 個(gè)濃度梯度 ：25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1），每一組設(shè)有 6 個(gè)復(fù)孔。樺褐孔菌用DMSO配成100 mmol·L-1母液，各組用DMSO補(bǔ)足等體積。24 h之后，CoCl2組和樺褐孔菌各組分別加入CoCl2，使最終濃度達(dá)到500 μmol·L-1， control組用雙蒸水補(bǔ)足等體積。在37℃下，繼續(xù)孵育24 h， 利用CCK8法對(duì)人體心肌細(xì)胞活力進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 Hoechst33342染色觀察細(xì)胞的形態(tài)

細(xì)胞以每孔5×104（500 mL）密度接種于預(yù)先放有蓋玻片的24孔板內(nèi)。試驗(yàn)分成3組，分別有control組、CoCl2組和樺褐孔菌+CoCl2組。經(jīng)過(guò)24 h之后，樺褐孔菌+CoCl2組加入終濃度為100μmol·L-1的樺褐孔菌預(yù)作用24 h，利用DMSO對(duì)體積進(jìn)行補(bǔ)足。24 h之后，加入500 μmol·L-1在CoCl2組和樺褐孔菌+CoCl2組中，利用雙蒸水對(duì)control組進(jìn)行體積補(bǔ)足。并且在培養(yǎng)箱中對(duì)其培養(yǎng)24 h，按照Hoechst 33342說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察人體心肌細(xì)胞的形態(tài)。

1.3.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)人體心肌細(xì)胞凋亡

利用PI熒光染色方法。對(duì)每組培養(yǎng)瓶中的人體心肌細(xì)胞進(jìn)行收集，收集在離心管中，貼壁的細(xì)胞經(jīng)過(guò)消化之后，與原瓶的懸浮細(xì)胞進(jìn)行混合，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，并在冷磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行洗滌[5]，操作2次，隨后調(diào)整為1×106個(gè)/mL，順著管壁加入1 mL于-20℃預(yù)冷的70%乙醇， PBS進(jìn)行2次洗滌可以有效去除固定液，加入800 μL PI染色液并將其混勻，在4℃避光下進(jìn)行30 min的染色，每1組重復(fù)4次操作，隨后上機(jī)檢測(cè)。利用流式細(xì)胞儀[6]檢測(cè)樣品時(shí)，每次的細(xì)胞計(jì)數(shù)為6 000個(gè)。利用軟件CellQuest[7]來(lái)檢測(cè)人體心肌細(xì)胞的凋亡率。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理所有數(shù)據(jù)，用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來(lái)表示結(jié)果。采用ANOVA分析法來(lái)檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義。

2 結(jié)果

2.1 樺褐孔菌對(duì)人體心肌細(xì)胞活力的影響

樺褐孔菌醇對(duì)細(xì)胞的處理時(shí)間設(shè)置為24 h、48 h、72 h，樺褐孔菌對(duì)人體心肌細(xì)胞活力的影響見(jiàn)圖1。

圖1 與對(duì)照組相比Fig.1 Compared to the control group

由圖 1可知，在 50～125 μmol·L-1范圍中對(duì)人體心肌細(xì)胞活力提升效果不同，在24 h時(shí)，對(duì)照組細(xì)胞存活率為74%，而樺褐孔菌醇的濃度為50 μmol·L-1、75 μmol·L-1、125 μmol·L-1細(xì)胞存活率分別為75%、78%、82%，樺褐孔菌醇濃度在125 μmol·L-1內(nèi)，細(xì)胞存活率增加，具有提升細(xì)胞存活率；24 h、48 h、72 h對(duì)照組的細(xì)胞存活率分別為75%、68%、64%，而試驗(yàn)組細(xì)胞存活率均有效提升，驗(yàn)證了樺褐孔菌對(duì)人體心肌細(xì)胞凋亡的抑制效果，具有頡頏作用。

2.2 樺褐孔菌對(duì)人體心肌細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果得到，樺褐孔菌醇會(huì)抑制人體心肌細(xì)胞的凋亡，提升細(xì)胞活力，見(jiàn)圖2。

圖2 樺褐孔菌對(duì)人體心肌細(xì)胞凋亡率的影響Fig.2 Effect of Inonotus obliquus on the apoptosis rate of human myocardial cells

由圖2可知，樺褐孔菌濃度分別為50 μmol·L-1、75 μmol·L-1、125 μmol·L-1對(duì)人體心肌細(xì)胞處理48 h之后細(xì)胞凋亡率的最高點(diǎn)分別約為22%、17%和10%，明顯比對(duì)照組的凋亡率（61%）低，說(shuō)明其作用的劑量依賴性較為明顯，且對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的頡頏作用明顯。

2.3 樺褐孔菌對(duì)人體心肌細(xì)胞Bax、BCL-2、Caspase-3和HIF基因的影響

經(jīng)過(guò)CoCl2的誘導(dǎo)之后，人體心肌細(xì)胞凋亡基因Caspase和Bax得到了提高，而經(jīng)過(guò)樺褐孔菌預(yù)處理之后明顯下降，經(jīng)過(guò)CoCl2誘導(dǎo)之后的人體心肌細(xì)胞抗凋亡基因BCL-2降低，樺褐孔菌在進(jìn)行預(yù)作用的24 h之后有效降低，單獨(dú)的CoCl2在對(duì)人體心肌細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)，能夠使HIF基因得到上升，樺褐孔菌經(jīng)過(guò)預(yù)處理時(shí)候使HIF基因的降低效果十分明顯，見(jiàn)圖3。

圖3 樺褐孔菌對(duì)凋亡基因的影響Fig.3 Effect of Inonotus obliquus on apoptotic genes

綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，樺褐孔菌能夠抑制凋亡基因的產(chǎn)生，使經(jīng)過(guò)CoCl2誘導(dǎo)后的人體心肌細(xì)胞凋亡基因Caspase和Bax的得到有效降低，同時(shí)使HIF基因下降，抑制人體心肌細(xì)胞的凋亡，頡頏效果明顯[8]。

3 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，在真菌藥用植物中分離出較多的活性物質(zhì)，說(shuō)明藥用植物中的真菌對(duì)開(kāi)發(fā)藥物能夠起到重要作用。其中樺褐孔菌分作為重要的藥用菌，能夠有效改善當(dāng)人體心肌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。樺褐孔菌在人體心肌缺血再灌注損傷中具有重要意義。但對(duì)樺褐孔菌對(duì)人體心肌細(xì)胞凋亡中的頡頏效果研究較為淺顯。為了對(duì)其進(jìn)行探討選擇人體心肌細(xì)胞當(dāng)作研究對(duì)象，利用樺褐孔菌醇對(duì)細(xì)胞凋亡的頡頏進(jìn)行檢測(cè)，揭示了樺褐孔菌在細(xì)胞中的作用。通過(guò)試驗(yàn)可知，樺褐孔菌醇提升細(xì)胞的活力，并且利用流式細(xì)胞儀測(cè)試樺褐孔菌對(duì)人體心肌細(xì)胞凋亡的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)該真菌醇能夠減低人體心肌細(xì)胞的凋亡情況，對(duì)心肌細(xì)胞凋亡具有一定的頡頏作用，也為樺褐孔菌的合理使用奠定了基礎(chǔ)。