趙航軻 ，彭 浩 **，盧雨欣

（1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中 723000）

羊肚菌屬于真菌子囊真菌，是世界四大珍貴食用菌之一[1]。其富含多種氨基酸，9種為人體必需氨基酸，約占氨基酸總含量的40%[2]，而且24.5%的蛋白質(zhì)，具有很高的營養(yǎng)價值[3]。此外，研究發(fā)現(xiàn)羊肚菌多糖和蛋白質(zhì)[4]，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和降低膽固醇等重要活性，對抗腫瘤藥物的研究與開發(fā)具有重要意義。

羊肚菌生長環(huán)境要求較為特殊，子實體形成困難且產(chǎn)量不穩(wěn)定。關(guān)于羊肚菌最早栽培的記載為1883年，之后的100多年有許多關(guān)于羊肚菌栽培出菇的報道[5-8]。自1982年羊肚菌室內(nèi)人工栽培成功以來，世界各地相關(guān)研究人員都在羊肚菌人工栽培技術(shù)上不斷突破更新[9-10]。從羊肚菌的制種、栽培環(huán)境、外援營養(yǎng)等生產(chǎn)宏觀角度以及從分子生物學(xué)水平研究羊肚菌代謝機(jī)理等生物學(xué)微觀角度多方面研究，不斷優(yōu)化羊肚菌人工栽培技術(shù)。近年來，國內(nèi)羊肚菌人工栽培發(fā)展迅速，栽培面積不斷增大，市場交易量日益增加[11]。但對羊肚菌人工栽培技術(shù)尚未完全突破，而實現(xiàn)羊肚菌商業(yè)化栽培最重要的是成熟穩(wěn)定的菌種和良好的栽培環(huán)境[12-13]。

漢中市位于陜西的中南部，屬北亞熱帶內(nèi)陸性季風(fēng)氣候，陽光充足，溫度適宜，降雨較多，空氣濕度大，雨季一般在9月份[14]。漢中市地處秦巴山區(qū)，食（藥）用菌種類多，自然條件適宜野生食用菌的生長，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，秦巴山區(qū)分布有一百余種野生食藥用菌[15]。羊肚菌屬偏低溫高濕型菌類，在形成原基與子實體時需要大量水分，因此在漢中地區(qū)進(jìn)行羊肚菌的人工栽培具有先天的自然優(yōu)勢。

通過對漢中各地區(qū)采集野生及試栽羊肚菌菌株進(jìn)行試驗室分離、純化、鑒定、制種及人工栽培，經(jīng)初篩、復(fù)篩及中試試驗不斷進(jìn)行人工馴化，初步確定適合漢中人工栽培的羊肚菌菌種，為漢中地區(qū)羊肚菌高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的商業(yè)化栽培奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

供試菌株由陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心從各地區(qū)收集的野生及試栽羊肚菌，經(jīng)試驗室分離純化制備菌種，采集地點、形態(tài)描述、菌種編號見表1。

表1 野生羊肚菌信息匯總Tab.1 Summary of wild Morchella

1.1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、瓊脂18 g、維生素B110mg，純化水1 000 mL，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 菌種分離純化

將采集的羊肚菌子實體用自來水輕輕沖洗，去除表面附著的泥沙，用滅菌后脫脂棉蘸取75%的乙醇對子實體進(jìn)行5次表面消毒，用無菌水沖洗5次，去除殘留乙醇，將羊肚菌子實體放至裝有0.1%的升汞溶液的燒杯中浸泡45 s，取出用無菌水沖洗5次，濾紙充分吸干表面水分，打開鼓風(fēng)紫外線消毒15min，用無菌操作從菌蓋和菌柄結(jié)合處切取0.5 mm2塊莖，接種至加入抗生素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，并對接種的菌種不斷進(jìn)行轉(zhuǎn)接純化， 純化后置于4℃冰箱保存。

菌株鑒定：將純化好的羊肚菌接種于PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，采用插片法觀察其菌絲顯微形態(tài)，有無分支和菌絲橫隔，結(jié)合相關(guān)參考文獻(xiàn)進(jìn)行初步鑒定。利用 CTAB法提取羊肚菌菌絲體 DNA，真菌引物（ITS 1/ITS 4）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。所得序列在 NCBI 中進(jìn)行比對分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)進(jìn)行種屬鑒定。

1.2.2 菌種制備

原種制備：菌種活化后，制備液體種，170 r·min-1、24℃培養(yǎng)10 d，制備原種。

原種培養(yǎng)基：采用5種培養(yǎng)基制備原種，如表2所示。含水量55%～65%，121℃滅菌4 h晾涼后，無菌接種，至24℃恒溫避光培養(yǎng)25 d，以菌絲生長速度、菌核數(shù)量、菌絲致密度為標(biāo)準(zhǔn)篩選最佳原種培養(yǎng)基。

表2 原種培養(yǎng)基組成成分Tab.2 Composition of primary medium

栽培種制備：通過原種培養(yǎng)基篩選，將5種長勢良好的原種培養(yǎng)基作為栽培種培養(yǎng)基，見表3。通過滿袋時間、菌絲致密度、菌核質(zhì)量選取最終最適栽培種培養(yǎng)基。

表3 栽培種培養(yǎng)基篩選Tab.3 Selection of cultivated species components

1.2.3 栽培地點選擇，拱棚搭建及土壤處理

選址和建棚：選擇土質(zhì)疏松、富含腐殖質(zhì)，pH為5～7，含沙量為15%，噴水及排水良的土壤，建立5 m× 20 m× 2.5 m 規(guī)格拱棚，選擇透光度為70%左右的遮蔭網(wǎng)進(jìn)行搭建。搭建遮蔭棚要注意牢固，大棚四周用薄膜覆蓋，棚內(nèi)面積約為50 m2。注意留有通風(fēng)口，以保證通風(fēng)良好。

建畦及開廂：將土壤中的一切雜物去除掉。在處理過的地畦上均勻撒生石灰來消毒。每個大棚內(nèi)兩畦，每畦用工具開播深10 cm、寬15 cm的溝槽，約30 m2，每個菌種栽培兩畦。使用生石灰消毒（22.5 g·m-2）后，再進(jìn)行松土和整地，松土深度為25 cm左右。開廂操作和松土是同步進(jìn)行的。廂高一般為20 cm左右，寬度約1.2 m，兩廂之間需要有廂溝，廂溝用來排水和人員通行。廂溝一般寬0.4 m、深0.25 m左右。

1.2.4 播種及外援營養(yǎng)

選擇10月下旬至11月下旬進(jìn)行播種，溫度為4℃～18℃。播種：將所有用具嚴(yán)格滅菌，以防止菌種污染。將長勢良好、生命力強(qiáng)、無雜菌污染的栽培種掰成2 cm～4 cm的碎塊，均勻撒在之前做好的溝槽內(nèi)，然后在菌絲上覆蓋厚5 cm的土層。在播種后10 d～15 d左右，擱置營養(yǎng)袋以補(bǔ)充營養(yǎng)成分。在營養(yǎng)袋上劃出10 cm左右的口，將劃開口的一側(cè)緊貼菌床橫放，或在營養(yǎng)袋一側(cè)均勻扎孔，將扎一側(cè)緊貼菌床放置，施加密度為3 袋/m2～4 袋/m2。為防止雜菌污染，擱置30 d后，除去營養(yǎng)袋。

1.2.5 出菇管理及采摘

濕度控制：羊肚菌出菇時對水分要求高，此時土壤含水量應(yīng)提高到70%并保持在一定水平。羊肚菌出菇后應(yīng)減少土壤含水量，控制在40%～50%，空氣濕度保持在55%～90%。

溫度控制：出菇棚內(nèi)應(yīng)維持在10℃～15℃。出菇后溫度應(yīng)控制在25℃以下，溫度過高會灼傷羊肚菌子實體，影響產(chǎn)量。棚內(nèi)溫度過高時應(yīng)及時通風(fēng)降溫，必要時掀開薄膜大棚，搭建雙重以上遮陽網(wǎng)。

光照控制：羊肚菌出菇階段應(yīng)減少光照。大棚增加遮蔭網(wǎng)以降低透光度至20%左右。

羊肚菌的采收：羊肚菌出菇速度快，采收時間也很短。一般羊肚菌出菇10 d后進(jìn)行羊肚菌采集。羊肚菌脊棱即將破損的時候及時采收。采集羊肚菌時，用刀在羊肚菌子實體菌柄與土壤相接處平割，勿傷原基。將羊肚菌子實體的形態(tài)特征及產(chǎn)量進(jìn)行詳細(xì)記錄，初步篩選出其中產(chǎn)量高、品質(zhì)好的菌株。

1.2.6 復(fù)篩試驗

2016年～ 2017年，在漢中市武鄉(xiāng)鎮(zhèn)進(jìn)行栽培試驗，分別在林下和大棚進(jìn)行對比，根據(jù)初篩菌絲萌發(fā)時間、菌霜期出現(xiàn)時間以及子實體品質(zhì)和產(chǎn)量，對栽培方式進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，羊肚菌最適栽培方式是棚內(nèi)栽培， 便于調(diào)整土壤及空氣溫度、濕度。同時，在播種前對菌種添加拌菌劑，可以為菌種提供一定的營養(yǎng)物質(zhì)和菌種播種初保持一定濕度。每個菌種做3個重復(fù)，每個重復(fù)栽培面積為30 m2，詳細(xì)記錄子實體的產(chǎn)量及品質(zhì)，進(jìn)一步篩選出其中產(chǎn)量高品質(zhì)好的菌株進(jìn)行下一階段中試試驗。

1.2.7 中試試驗

2017年～ 2018年，在漢中武鄉(xiāng)鎮(zhèn)進(jìn)行栽培試驗。營養(yǎng)方式及出菇管理根據(jù)復(fù)篩進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)觀察，菌絲不能完全利用營養(yǎng)袋，采取縮小體積營養(yǎng)袋、增大單位面積營養(yǎng)袋數(shù)量的方式，菌絲可以充分利用營養(yǎng)袋，即在播種后10 d～15 d左右，施加營養(yǎng)袋為4 袋 /m2～6 袋 /m2， 同時在菌絲萌發(fā)后，當(dāng)氣溫達(dá)到零度以下，菌霜不能及時出現(xiàn)，在地畦表面覆蓋黑地膜，保持地畦表面土壤溫濕度，確保菌絲生長活力。每個菌種做3個重復(fù)，每個重復(fù)栽培面積為100 m2。

1.2.8 部分地區(qū)推廣試驗

2018年以來，在漢中市武鄉(xiāng)、南鄭、城固縣等羊肚菌栽培基地對篩選出的羊肚菌進(jìn)行示范推廣。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩試驗結(jié)果與分析

對野生羊肚菌進(jìn)行分離純化和鑒定后，優(yōu)化制備栽培種培養(yǎng)基組分為木屑20.0%、谷殼25.0%、小麥32.0%、麩皮10.0%、腐殖土10.0%、生石灰1.5%、石膏 1.5%，播種后 LU-01、LU-02、LU-03、LB-01、NZ-01、NZ-02、NZ-03未出菇，其他羊肚菌菌株子實體出菇產(chǎn)量相對較高，篩選試驗見表4。

表4 羊肚菌栽培初篩試驗結(jié)果Tab.4 Results of Morchella cultivation preliminary screening test

由表4可知，篩選出MX-02、MX-03、MX-04、LB-01、LB-02、LB-03、CG-01 7個為較優(yōu)菌株。

2.2 復(fù)篩試驗結(jié)果與分析

LB-01、CG-01幾乎未出菇，LB-02出菇少，即表明以上菌株穩(wěn)定性低，抗逆性差，不能進(jìn)行后續(xù)試驗，MX-02、MX-03、MX-04、LB-03 4株羊肚菌出菇產(chǎn)量較高、品質(zhì)較好，見表5。

表5 羊肚菌栽培復(fù)篩試驗結(jié)果Tab.5 Results of Morchella cultivation rescreen test

由表5可知，說明這幾株菌具有人工馴化的可能性，可以進(jìn)行下一步中試試驗。

2.3 中試試驗結(jié)果與分析

根據(jù)初篩復(fù)篩對試驗過程中播種前菌種預(yù)處理及播種后棚內(nèi)保溫保濕相關(guān)技術(shù)改進(jìn)，進(jìn)行中試試驗，見表6。

表6 羊肚菌栽培中試試驗結(jié)果Tab.6 Experimental results of Morchella cultivation

由表6可知，MX-02、MX-04、LB-03均能穩(wěn)定出菇， 且子實體形態(tài)穩(wěn)定， 畸形菇較少，產(chǎn)量較高。

2.4 推廣試驗結(jié)果與分析

將試驗篩選出的MX-02、MX-04、LB-03在漢中市武鄉(xiāng)鎮(zhèn)、城固縣、南鄭縣進(jìn)行初步推廣，其中在武鄉(xiāng)推廣的MX-02平均產(chǎn)量為2 481 kg·hm-2、MX-04平均產(chǎn)量為2 652 kg·hm-2、LB-03平均產(chǎn)量為2 151 kg·hm-2，在南鄭推廣的MX-02平均產(chǎn)量為2 227.5 kg·hm-2、LB-03 平均產(chǎn)量為 2 272.5 kg·hm-2，在城固推廣的MX-04平均產(chǎn)量為1 882.5 kg·hm-2。

3 結(jié)語

試驗通過收集漢中市各地區(qū)野生及試栽羊肚菌子實體進(jìn)行分離純化和鑒定，將純化后的菌種進(jìn)行初篩、復(fù)篩、中試試驗篩選出穩(wěn)定性和抗逆性較強(qiáng)的羊肚菌菌種。通過播種前將菌種揉碎后添加拌種劑，為菌絲提供一定的含水量及營養(yǎng)物質(zhì)。營養(yǎng)袋施加過程中通過縮小營養(yǎng)袋體積而增大單位面積施加量，使菌絲能夠充分利用營養(yǎng)。出菇管理過程中由于低溫造成結(jié)霜未及時出現(xiàn)，采用覆膜等方式及時進(jìn)行保溫、保濕等相關(guān)技術(shù)改進(jìn)，使羊肚菌產(chǎn)量和性狀維持相對穩(wěn)定的狀態(tài)。最終得到3株優(yōu)勢較強(qiáng)的羊肚菌，其中MX-02和MX-04為六妹羊肚菌，LB-03為梯棱羊肚菌，為漢中地區(qū)羊肚菌的商業(yè)化栽培奠定理論基礎(chǔ)。