車曉平 王天園 王宏 韓旭陽 彭冰 曾祖平

摘要目的：建立狼瘡合劑的質量控制標準。方法：對狼瘡合劑中淫羊藿、雞血藤、黃芪、白術進行薄層色譜法定性鑒別，對君藥秦艽含有的龍膽苦苷進行高效液相色譜法含量測定。結果：薄層色譜圖特征斑點清晰、分離較好，陰性對照無干擾;龍膽苦苷在0.202 5～3.24 μg范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系，平均加樣回收率為102.56%，RSD=1.57%（n=6），3批狼瘡合劑中龍膽苦苷平均含量為1.70 mg/mL。結論：本法準確、靈敏，重復性好，為狼瘡合劑的質量控制提供了依據。

關鍵詞狼瘡合劑;龍膽苦苷;高效液相色譜法;薄層色譜法

中圖分類號：R283文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.01.015

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是自身免疫介導的、累及全身各個系統(tǒng)，以免疫性炎性反應為突出表現(xiàn)的彌漫性結締組織病[1]，《中藥新藥臨床研究指導原則》將系統(tǒng)性紅斑狼瘡分為熱毒熾盛、陰虛內熱、瘀熱痹阻、風濕熱痹、脾腎陽虛、肝腎陰虛、氣血兩虛等7個證型[2]，中醫(yī)臨床根據患者病情辨證治療。狼瘡合劑為首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院院內制劑，由黃芪、秦艽、黨參等11味中藥組成，功效為健脾益腎、活血解毒通絡，用于脾腎兩虛引起的紅斑狼瘡，有較好的療。

狼瘡合劑的原質量標準僅對黃芪進行了薄層色譜鑒別，為了保障臨床用藥的安全性和有效性。本研究采用薄層色譜法建立了雞血藤、白術、淫羊藿、黃芪的定性鑒別標準，并對君藥秦艽含有的龍膽苦苷進行高效液相色譜法含量測定。

1材料

1.1儀器GT101高速離心機（北京時代北利離心機有限公司），H.H.S21.4電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械三廠），XS205電子天平（METTLER TOLEDO），SK7210HP超聲波清洗機（上?？茖С晝x器有限公司），YOKOZS薄層色譜成像儀、YOKOPX噴霧顯色抽氣箱、YOKOPN電動噴霧器（武漢藥科新技術開發(fā)有限公司），Agilent 1100高效液相色譜儀（Agilent）。

1.2試劑硅膠G薄層板、硅膠GF254薄層板（青島海洋化工廠分廠），0.22 μm微孔濾膜（津騰），所用試劑均為分析純（北京化學試劑公司）。

1.3分析樣品狼瘡合劑處方飲片（北京杏林藥業(yè)有限責任公司）;狼瘡合劑（首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院;批號：20140707、20140708、20140709）;雞血藤對照藥材（121173200902），白術對照藥材（120925200708），龍膽苦苷對照品（110770201013），淫羊藿苷對照品（7379203），黃芪甲苷對照品（7819202），均購于中國藥品生物制品檢定所。

2方法與結果

2.1狼瘡合劑中雞血藤、白術、淫羊藿、黃芪的薄層色譜鑒別[34]

2.1.1雞血藤的薄層色譜鑒別取狼瘡合劑20 mL，每次加入乙醚20 mL振搖提取2次，將乙醚液合并、蒸干，用乙酸乙酯1 mL將殘渣溶解，作為供試品溶液。按狼瘡合劑制備工藝配制無雞血藤的空白合劑，同法制得不含雞血藤的陰性對照品溶液。另取雞血藤對照藥材3 g，加水50 mL，煎煮30 min，放冷后濾過，所得濾液按供試品溶液制備方法制得雞血藤對照藥材溶液。按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0502薄層色譜法[6]，分別吸取上述雞血藤陰性對照品溶液與供試品溶液各10 μL、雞血藤對照藥材溶液5 μL，點于同一硅膠G薄層板上，用展開劑正己烷乙酸乙酯甲苯（5∶2∶1）展開，取出并晾干，以三氯化鋁溶液噴霧顯色，置365 nm紫外光燈下進行檢視。在供試品色譜中，與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性樣品無干擾[5]。見圖1。

2.1.2白術的薄層色譜鑒別按狼瘡合劑制備工藝配制無白術的空白合劑，照2.1.1項下供試品溶液制備方法制得不含白術的陰性對照品溶液。取白術對照藥材0.5 g，加乙醚20 mL進行超聲處理20 min，濾過后將濾液蒸干，用甲醇2 mL將殘渣溶解作為白術對照藥材溶液。按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0502薄層色譜法，分別吸取白術陰性對照品溶液及2.1.1中供試品溶液各10 μL、白術對照藥材溶液5 μL，點于同一硅膠G薄層板上，用展開劑正己烷乙酸乙酯甲苯（5∶2∶1）展開，取出并晾干，以對二甲氨基苯甲醛試液噴霧顯色，熱風吹干后置365 nm紫外光燈下檢視。在供試品色譜中，與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性樣品無干擾[7]。見圖2。

2.1.3淫羊藿的薄層色譜鑒別將2.1.1中剩余的水層每次用乙酸乙酯20 mL振搖提取2次，將乙酸乙酯液合并蒸干，用甲醇1 mL將殘渣溶解，作為供試品溶液。按狼瘡合劑制備工藝配制無淫羊藿的空白合劑，照供試品溶液制備方法制得不含淫羊藿的陰性對照品溶液。另取淫羊藿苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg淫羊藿苷的對照品溶液。按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0502薄層色譜法，分別吸取淫羊藿陰性對照品溶液及供試品溶液各10 μL、淫羊藿苷對照品溶液2 μL，點于同一硅膠G薄層板上，用展開劑丁酮甲酸乙酸乙酯水（1∶1∶10∶1）展開，取出，晾干，以三氯化鋁試液噴霧顯色，置365 nm紫外光燈下檢視。在供試品色譜中，與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性樣品無干擾[8]。見圖3。

2.1.4黃芪的薄層色譜鑒別將2.1.3中剩余的水層用水飽和正丁醇振搖提取2次，20 mL/次，合并正丁醇液，依次用氨水、正丁醇飽和水洗滌1次，30 mL/次，蒸干正丁醇液，用甲醇1 mL將殘渣溶解，作為供試品溶液。按狼瘡合劑制備工藝配制無黃芪的空白合劑，照供試品溶液制備方法制得不含黃芪的陰性對照品溶液。另取黃芪甲苷對照品適量，加乙醇制成每1 mL含1 mg黃芪甲苷的對照品溶液。按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0502薄層色譜法，分別吸取黃芪陰性對照品溶液及供試品溶液各10 μL、黃芪甲苷對照品溶液2 μL，點于同一硅膠G薄層板上，用展開劑甲醇三氯甲烷水（7：13：2）的下層溶液展開，取出并晾干，以10%硫酸乙醇溶液噴霧，加熱至清晰顯色出斑點。在供試品色譜中，與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點;365 nm紫外光燈下顯相同顏色的熒光斑點;陰性樣品均無干擾[9]。見圖4。

2.2狼瘡合劑中龍膽苦苷的含量測定[1011]

2.2.1色譜條件色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱;流動相：0.1%甲酸乙腈（90∶10）;檢測波長：270 nm;柱溫：室溫;流速：1.0 mL/min。

2.2.2對照品溶液的制備取龍膽苦苷對照品20.25 mg精密稱定，加甲醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3陰性對照品溶液的制備按制劑工藝制備不含秦艽的空白合劑，取5 mL置于25 mL容量瓶中，加水至刻度，定容，用0.22 μm的微孔濾膜濾過，即得。

2.2.4供試品溶液的制備精密量取離心后的狼瘡合劑上清液1 mL，置25 mL容量瓶中，加水20 mL，超聲5 min，加水定容至25 mL，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜濾過，即得。

2.2.5專屬性試驗精密吸取秦艽陰性對照品溶液、龍膽苦苷對照品溶液與狼瘡合劑供試品溶液各10 μL，分別進樣。龍膽苦苷與其他組分可達到基線分離，陰性對照無干擾。見圖5。

2.2.6線性關系考察將對照品溶液分別進樣0.5、1、2、4、6、8 μL，依照2.2.1色譜條件測定峰面積。以橫坐標為龍膽苦苷進樣量（X）、縱坐標為峰面積積分值（Y）制作標準曲線，獲得龍膽苦苷線性回歸方程Y=1 255.2X1.306 7（r=0.999 99，n=6）。結果表明，在0.202 5～3.24 μg范圍內，龍膽苦苷進樣量與峰面積積分值線性關系良好。

2.2.7中間精密度試驗取相同供試品溶液，連續(xù)進樣6次，每次10 μL，測定龍膽苦苷峰面積積分值，計算龍膽苦苷含量，結果RSD為1.37%（n=6），表明所用儀器的精密度良好。

2.2.8供試品溶液穩(wěn)定性試驗取相同供試品溶液，在0、2、4、6、8 h每次進樣10 μL，測定龍膽苦苷峰面積積分值，計算龍膽苦苷含量，結果RSD=0.89%（n=5），表明龍膽苦苷在供試品溶液中8 h內穩(wěn)定。

2.2.9重復性試驗分6次精密吸取相同批號狼瘡合劑，每次1 mL，按2.2.3項下供試品溶液制備方法制備，進樣10 μL，測定龍膽苦苷峰面積積分值，計算含量，結果龍膽苦苷平均含量1.767 mg/mL，RSD=1.23%（n=6），表明龍膽苦苷的含量測定方法重復性良好。

2.2.10回收率試驗精密吸取已知含量的樣品0.5 mL，共6份，置于25 mL量瓶中，分別精密加入濃度為0.405 mg/mL的對照品溶液3 mL，加水15 mL，超聲5 min，加水定容至25 mL，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜濾過，即得供試液。精密吸取供試液10 μL，依法測定，計算，結果平均回收率為102.56%，RSD=1.57%（n=6）。見表1。

2.2.11耐用性試驗選擇2種不同品牌色譜柱，分別為kromasil 1005c18 150 mm×4.6 mm;Agilent ZORBAX Eclipse XDBC18 2.1 mm ×150 mm，依法測定同一批號樣品。結果表明，使用2種不同品牌的色譜柱，供試品溶液中龍膽苦苷峰均能達基線分離，分離度符合要求，測定結果不受影響，方法耐用性良好。

2.2.12樣品測定結果取3批次狼瘡合劑，按2.2.3項下分別制成供試品溶液，依照2.2.1色譜條件每批次進樣10 μL測定龍膽苦苷含量。見表2。

3討論

3.1薄層色譜鑒別對處方中其他藥味也進行了薄層色譜研究。1）鑒別黨參[12]時，供試液曾經嘗試用2.1.4中的供試品溶液、氨水洗滌液部分或正丁醇飽和水洗滌液部分;采用正丁醇冰醋酸水（7∶1∶0.5）、三氯甲烷甲醇水（13∶7∶2）的下層溶液等做展開劑。結果供試品中與黨參炔苷對應位置斑點均不清晰，未收載于正文。2）鑒別拳參[13]時，以綠原酸、沒食子酸和拳參藥材作為陽性對照，考察展開劑二氯甲烷乙酸乙酯甲酸（5∶4∶1）、乙酸丁酯甲酸水（7∶2.5∶2.5）上層。結果2.1.3中供試品與綠原酸似有對應斑點，而在與沒食子酸相應位置陰性有干擾。此鑒別特異性不強，未收載于正文。3）鑒別女貞子時，曾經嘗試《中華人民共和國藥典》收載方法[13]，結果供試品中與齊墩果酸對應位置無明顯斑點;將女貞子藥材水煎后依次用乙酸乙酯、水飽和正丁醇振搖提取、濃縮后作為陽性對照，結果乙酸乙酯部分在二氯甲烷乙酸乙酯甲酸（5∶4∶1）的展開條件下，與沒食子酸相應位置陰性有對應斑點，表明二者相互干擾，未收載于正文。4）鑒別丹參時，考慮制劑的工藝特點，選擇鑒別丹參中的水溶性成分。以2.1.3項下供試液采用藥典方法[13]鑒別丹酚酸B，效果不佳。后參考文獻方法[14]，取丹參藥材1.5 g，加水20 mL，煎煮30 min，放冷，濾過，濾液用鹽酸調pH約為2，其余同2.1.3供試品溶液制備，得到丹參對照藥材溶液;并按處方比例，稱取除丹參以外的其他飲片，按成品制備工藝制成空白制劑，再按2.1.3項下供試液制備方法制備，得丹參陰性對照溶液;以甲苯乙酸乙酯甲酸（5∶4∶1）為展開劑、3%三氯化鐵乙醇液為顯色劑，結果主斑點陰性有干擾。未收載于正文。

3.2含量測定秦艽既能外散風濕舒筋活絡，又能內泄?jié)駸?、涼血退蒸，為風藥中之潤劑，散藥中之補劑，具有抗炎、抗氧化、調節(jié)免疫中樞系統(tǒng)、保肝、升血糖等廣泛的藥理活性[15]，在狼瘡合劑中為君藥。秦艽中主要有效成分為龍膽苦苷，為《中華人民共和國藥典》中規(guī)定的含量測定成分[13]。

根據文獻以及藥典中龍膽苦苷的含量測定方法，實驗中考察了甲醇水（25∶75）、0.1%甲酸乙腈（90∶10）2種流動相，使用甲醇水（25∶75）的流動相分離效果不好，故舍棄?？疾炝?70 nm、254 nm 2種波長，比較后得出在波長270 nm下達到最大吸收，且分離效果好，陰性無干擾，故選擇波長270 nm。

狼瘡合劑的薄層色譜鑒別和含量測定方法重現(xiàn)性好，簡便易行，為安全有效的用藥提供了一個合理依據，可較好地控制狼瘡合劑的質量。

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（2016-07-05收稿責任編輯：楊覺雄）