李強　黃杰　雷思敏　肖榕　吳萍　廖端芳　林艷

〔摘要〕 目的 探討玉竹干預(yù)陰虛大鼠模型的有效部位，分離純化玉竹多糖（Polygonatumodoratum Polysaccharides， POP），并對其基本理化性質(zhì)進行分析。方法 制備玉竹水總提取物（Ⅰ）、醇沉上清液（Ⅱ）和醇沉淀（Ⅲ）3個部位，大鼠腹腔注射三碘甲狀腺原氨酸（T3），每日1次，連續(xù)1周，建立陰虛大鼠模型。檢測各部位對陰虛大鼠體質(zhì)量及體溫變化的影響，采用Elisa法檢測大鼠血清游離三碘甲狀腺原氨酸（fT3）、游離四碘甲狀腺原氨酸（fT4）、血漿環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）水平。采用DEAE-52纖維素柱層析對POP進行分離純化，并對各均一多糖進行理化性質(zhì)分析。結(jié)果 玉竹各部位均能顯著增加陰虛大鼠的體質(zhì)量，降低陰虛大鼠體溫，對陰虛大鼠血清fT3、fT4、血漿cAMP、cGMP水平紊亂調(diào)節(jié)作用顯著（P<0.01），且所含多糖的醇沉淀（Ⅲ）部位效果最佳。POP中分離得到1種中性多糖（POP1）和2種酸性多糖（POP2、POP3），其中POP1含量最高。結(jié)論 以中性多糖為主的玉竹多糖具有最佳滋陰藥效，該研究為玉竹多糖的進一步開發(fā)提供了基礎(chǔ)。

〔關(guān)鍵詞〕 玉竹;陰虛大鼠模型;有效部位;玉竹多糖

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.01.009

Screening for Active Fractions of Polygonatum odoratum in a Rat Model of Yin Deficiency and Analysis of Their Physicochemical Properties

LI Qiang1，2， HUANG Jie1，2， LEI Simin1，2， XIAO Rong1，2， WU Ping1，2， LIAO Duanfang1，2*， LIN Yan1，2*

（1. School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Key Laboratory for Quality Evaluation of Bulk Herbs of Hunan Province， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the active fractions of Polygonatum odoratum in a rat model of Yin deficiency， to extract and purify Polygonatum odoratum polysaccharides （POPs）， and to analyze their physicochemical properties. Methods Three fractions were prepared from Polygonatum odoratum， including the whole-plant aqueous extract （POP1）， and supernatant （POP2） and precipitate （POP3） from ethanol precipitation. The rat model of Yin deficiency was established by intraperitoneal injection of triiodothyronine （T3） once a day for 1 week. The effect of the three fractions on the changes in body weight and temperature of the rats with Yin deficiency was evaluated. The levels of free triiodothyronine （FT3） and free tetraiodothyronine （FT4） in serum， and cyclic adenosine monophosphate （cAMP） and cyclic guanosine monophosphate （cGMP） in plasma were measured by ELISA. POPs were extracted and purified by DEAE-cellulose-52 chromatography， and the physicochemical properties of each homogeneous polysaccharide were analyzed. Results All the fractions showed a significant effect in increasing the body weight， reducing the temperature， and regulating the serum levels of FT3 and FT4 and plasma levels of cAMP and cGMP in the rats with Yin deficiency （P<0.01）， with the best effect observed in POP 3. One type of neutral polysaccharide （POP1） and two types of acidic polysaccharides （POP2 and POP3） were extracted from POPs， among which the content of POP1 was highest. Conclusion The best Yin-nourishment effect is observed in the neutral polysaccharide-dominated Polygonatum odoratum polysaccharide. This study provides a basis for the further development of Polygonatum odoratum polysaccharides.

〔Keywords〕 Polygonatum odoratum; rat model of Yin deficiency; active fraction; Polygonatum odoratum polysaccharide

玉竹為百合科植物玉竹Polygonatum odoratum （Mill.） Druce 的干燥根莖，是我國常用的中藥材。其味甘，微寒，能養(yǎng)陰潤燥、除煩止渴。玉竹主要含有甾體皂苷類、高異黃酮類、多糖類及揮發(fā)油類等成分[1]，其中多糖為主要有效成分?，F(xiàn)代研究表明，玉竹多糖具有降低血糖[2]、抗氧化[3]、調(diào)節(jié)免疫[4]等作用，廣泛用于疾病的預(yù)防和保健領(lǐng)域。陰虛是由于機體陰液不足，不能滋潤、不能制陽引發(fā)的一系列證候，臨床常見潮熱、手足心熱、形體消瘦、身體虛弱、身體乏力等。研究[5-6]表明，陰虛會引起交感神經(jīng)過度興奮，導(dǎo)致機體cAMP、cGMP水平紊亂，細(xì)胞功能的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)fT3和fT4與機體的陰陽平衡密切相關(guān)。六味地黃丸是一種良好的滋陰補腎藥，研究表明六味地黃丸能夠改善陰虛證，調(diào)節(jié)陰虛導(dǎo)致的大鼠血清fT3、fT4及cAMP、cGMP的紊亂，增加陰虛大鼠質(zhì)量，滋陰效果良好[7-8]。玉竹具有養(yǎng)陰益氣、降低血糖的功效，能夠調(diào)節(jié)內(nèi)分泌，增強免疫力，對肺胃陰傷、內(nèi)熱消渴等陰虛癥具有良好治療效果。因此，本文首先采用三碘甲狀腺原氨酸（T3）創(chuàng)建陰虛大鼠模型，以六味地黃丸為陽性對照藥進行玉竹不同部位滋陰藥效的篩選，然后對有效部位進行分離純化并對其基本理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)類型進行研究，以期為玉竹的進一步開發(fā)利用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1? 試驗動物

SD大鼠，體質(zhì)量（190～210）g，由湖南施萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK（湘）2013-2014。

1.2? 主要藥品與試劑

玉竹（湖南邵東縣玉竹種植基地提供，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)龔力民副教授鑒定）;六味地黃丸（九芝堂股份有限公司）;T3（Sigma公司）;fT3、fT4、cAMP、cGMP Elisa試劑盒（BD公司）;DEAE-52纖維素、葡萄糖、沒食子酸（國藥控股股份有限公司）;重蒸苯酚、明膠（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司）;透析袋、牛血清白蛋白（上海源葉生物科技有限公司）;無水乙醇、間羥基聯(lián)苯、四硼酸鈉、濃硫酸均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3? 主要儀器

酶標(biāo)儀（芬蘭Labsystens集團）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）;冷凍干燥機（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）。

2 方法

2.1? 玉竹水提物各部位的提取

部位Ⅰ：取玉竹原藥材，粉碎過60目篩，加蒸餾水（1∶40，W/V），超聲提?。?00 W， 30 min），重復(fù)2次，合并水提液，減壓濃縮得濃縮液并冷凍干燥。

部位Ⅱ：將部位Ⅰ的濃縮液加適量乙醇使乙醇終濃度為75%，靜置24 h，3 000 r/min離心15 min得上清液，減壓回收乙醇，冷凍干燥。

部位Ⅲ：將部位II所得沉淀物抽濾，適量乙醇洗滌，揮去乙醇至無味，冷凍干燥。

2.2? 動物分組、造模與給藥

按體質(zhì)量和性別將90大鼠隨機分為9組（每組10只，雌雄各半），即：正常組、模型組、部位Ⅰ低劑量組、部位Ⅰ高劑量組、部位Ⅱ低劑量組、部位II高劑量組、部位Ⅲ低劑量組、部位Ⅲ高劑量組、六味地黃丸組。各部位組每日按劑量（低：0.2 g/（Kg·d）， 高：0.4 g/（Kg·d）灌胃給藥），六味地黃丸組（LDPS）每日按劑量（濃縮丸7 g/（Kg·d）灌胃給藥），連續(xù)14 d。從第8天起，除正常對照組外各組大鼠腹腔注射T3溶液0.5 g/（Kg·d）連續(xù)1周[9]。

2.3? 指標(biāo)測定

動物于給藥前與停藥日測量體質(zhì)量 直腸溫度，計算體質(zhì)量增長率和體溫升高率，公式如下：

大鼠最后一次給藥后停食不停水，于次日使用普通采血管和抗凝采血管進行腹主動脈取血，離心吸取上清，分別獲得血清和血漿，按照Elisa試劑盒操作步驟測定大鼠血清fT3、fT4和血漿cAMP、cGMP水平。

2.4? 玉竹多糖的分離純化

用少量水將部位Ⅲ溶解，加入1/4倍體積的Sevage溶液（正丁醇-三氯甲烷1∶4）攪拌，4 ℃靜置1 h，5 000 r/min離心10 min，收集上清液，重復(fù)以上操作7次得脫蛋白多糖溶液，濃縮至無醇味，將此溶液滴加于DEAE-纖維素層析柱上，用去離子水、0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl溶液依次梯度洗脫，流速0.5 mL/min，收集餾分（l0 mL每管）[10]。硫酸-苯酚法隔管檢測490 nm處吸光度值，以收集的管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線，合并收集各均一性多糖，去離子水透析48 h以去除NaCl及其它小分子雜質(zhì)，經(jīng)真空冷凍干燥即可得各均一性多糖。

2.5? 多糖理化性質(zhì)分析

將玉竹多糖配制成2 mg/mL水溶液，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，按照硫酸-苯酚法測定總糖含量;以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，按照考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量;以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，按照間羥基聯(lián)苯法測定糖醛酸含量;以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，按照Folin-酚試劑法測定多酚含量;以氯化鋇為標(biāo)準(zhǔn)品，按照氯化鋇-明膠比色法測定硫酸根含量。

3 結(jié)果

3.1? 各部位對陰虛大鼠體質(zhì)量、體溫的影響

研究表明，陰虛患者代謝功能增強，體溫升高，形體消瘦[11]。實驗結(jié)果表明，模型組較正常組相比大鼠體重增長率明顯降低（P<0.01），體溫升高率顯著升高（P<0.01），說明建立的大鼠模型符合臨床陰虛癥特點。與模型組比較，給藥后各組大鼠體質(zhì)量增長率均有所增加，體溫升高率均有所降低。其中，部位Ⅱ低劑量組和LDPS組大鼠體質(zhì)量增長率明顯增加（P<0.01）;部位Ⅰ高、低劑量組，部位Ⅱ低劑量組，部位Ⅲ高劑量組和LDPS組大鼠體溫升高率顯著降低（P<0.01），說明玉竹各部位對改善陰虛癥狀具有顯著作用。結(jié)果見表1。

3.2? 各部位對陰虛大鼠血清fT3、fT4和血漿cAMP、cGMP的影響

陰虛患者血清fT3含量升高，fT4含量降低，其原因可能是fT3的生理活性遠(yuǎn)高于fT4，在體內(nèi)起主要作用，且fT3是由fT4內(nèi)環(huán)脫碘轉(zhuǎn)變而成，故由于代償?shù)脑驅(qū)е耭T4的變化趨勢與fT3完全相反[12-13]。與正常組相比，模型組大鼠血清fT3水平明顯升高，fT4水平明顯降低（P<0.01），說明陰虛大鼠造模成功。與模型組比較，玉竹部位Ⅱ、Ⅲ和LDPS均能明顯降低陰虛大鼠血清fT3水平（P<0.01），部位Ⅰ、Ⅱ治療組陰虛大鼠血清fT4含量顯著增加（P<0.01）。結(jié)果見表2。

陰虛者交感神經(jīng)異常興奮，cAMP水平升高，cGMP水平則降低，cAMP/cGMP升高[14-16]。由表2可知，模型組與正常組相比大鼠血漿cAMP水平明顯升高（P<0.01），cGMP明顯降低（P<0.01），cAMP/cGMP明顯升高（P<0.01），說明模型成功。給藥后各組大鼠血漿cAMP水平均有不同程度降低，且均具有顯著性差異（P<0.01）。各給藥組大鼠血漿cGMP水平較模型組均有升高，部位Ⅲ低、高劑量組升高最明顯（P<0.01），各治療組cAMP/cGMP顯著降低（P<0.01）。綜合考慮，后續(xù)選擇部位Ⅲ進行實驗。

3.3? 玉竹多糖的分離純化和理化性質(zhì)分析

Sevage法除去蛋白的玉竹多糖經(jīng)DEAE-纖維素層析柱純化，得多糖洗脫曲線，洗脫曲線具有3個分離度良好的峰，即獲得3個不同均一多糖，其中POP1是由去離子水洗脫得到，POP2由0.1 mol/L NaCl溶液洗脫得到、POP3由0.3、0.5 mol/L NaCl溶液洗脫得到，見圖1。根據(jù)硫酸-苯酚檢測結(jié)果，分離得到的3種多糖組分中POP1為中性多糖，含量最高，POP2、POP3為酸性多糖，含量較低，說明玉竹多糖主要為中性多糖，酸性多糖較少。結(jié)果見圖1。

硫酸-苯酚法測定總糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線為

Y=0.0 041X+0.032（r=0.9 992）;

考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線為

Y=206.49X-5.2 164（r=0.9 995）;

間羥基聯(lián)苯法測定糖醛酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線為

Y=0.0 025X+0.031（r=0.9 987）;

Folin-酚試劑法測定多酚含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線為

Y=0.0 024X+0.011（r=0.9 976）;

氯化鋇-明膠比色法測定硫酸根含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線為

Y=1.6X-0.03（r=0.9 997）。

多糖經(jīng)分離純化后，POP1、POP2、POP3的蛋白質(zhì)和多酚含量較低。POP1總糖含量高于POP2和POP3，而糖醛酸和硫酸根含量低于POP2和POP3。根據(jù)文獻研究，大部分多糖的活性高低主要取決于糖醛酸和硫酸根的含量，含量越高，多糖活性則越高，故推測POP2和POP3的活性高于POP1，這還需進一步的研究驗證。結(jié)果見表3。

4 討論

陰虛體質(zhì)是因機體陰液損耗而不能制陽，致使陽氣亢盛，機體代謝加快，產(chǎn)熱增加，虛熱內(nèi)生的病理狀態(tài)[17]。研究表明，機體代謝調(diào)節(jié)因子fT3、fT4、cAMP、cGMP與機體陰虛聯(lián)系密切，是用于評價陰虛模型和藥效的常用生理指標(biāo)[6]。甲狀腺素是能量代謝的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，能增強機體的基礎(chǔ)代謝，增加產(chǎn)熱，較長時間使用甲狀腺素可以導(dǎo)致形體消瘦、暴躁易怒等陰虛癥，同時相應(yīng)的生理指標(biāo)fT3、fT4、cAMP、cGMP也與陰虛體質(zhì)表現(xiàn)一致，因此，體內(nèi)實驗常采用口服或注射甲狀腺素來制備陰虛模型[18-19]。

本文對玉竹水提物的不同部位進行了藥效學(xué)研究，結(jié)果顯示部位Ⅱ、Ⅲ可以降低fT3、cAMP，提高fT4、cGMP，調(diào)節(jié)陰虛導(dǎo)致的體重下降和體溫升高，改善陰虛癥狀。陰虛與fT4水平的相關(guān)性目前仍無定論，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)陰虛體質(zhì)fT4水平明顯高于正常水平[14]，也有臨床調(diào)查結(jié)果顯示陰虛患者fT4水平顯著低于正常水平[13]。本實驗陰虛大鼠fT4水平明顯低于正常大鼠，可能是因為注射T3后大鼠fT3水平升高，從而負(fù)反饋性抑制TSH的合成與分泌，導(dǎo)致T4合成減少。本實驗結(jié)果表明玉竹滋陰藥效最佳的部位為多糖部位，通過進一步成分鑒定和含量測定，從中分離出3種均一性多糖，其中，中性多糖含量較高，酸性多糖較少。

由于本實驗發(fā)現(xiàn)部位Ⅱ也具有一定的滋陰效果，因此，課題組擬下一步對部位Ⅱ所含物質(zhì)進行成分分析，并通過體外實驗觀察部位Ⅱ和部位Ⅲ的滋陰藥效值，進而采用譜效相關(guān)性確定二者對藥效的相關(guān)貢獻度，為進一步開發(fā)玉竹奠定基礎(chǔ)。

參考文獻

[1] 楊慧潔，楊世海，張海弢，等.玉竹化學(xué)成分、藥理作用研究進展及開發(fā)利用現(xiàn)狀[J].人參研究，2012，24（3）：40-45.

[2] 丁登峰，向大雄，劉? 韶，等.玉竹多糖的提取及其對鏈脈佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠血糖的影響[J].中南藥學(xué)，2005，3（4）：222-224.

[3] 張軒銘，王冬梅，王? 瑾，等.不同產(chǎn)地玉竹黃酮提取物體外抗氧化活性研究[J].西北植物學(xué)報，2011，31（3）：628-631.

[4] 吳國學(xué).玉竹對小鼠免疫抑制調(diào)節(jié)作用的研究[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新， 2013，10（9）：13-14.

[5] 胡方林，劉仙菊，易法銀，等.益氣滋陰方調(diào)節(jié)甲亢模型大鼠甲狀腺激素的實驗研究[J].現(xiàn)在中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，17（25）：3902-3903.

[6] 黃江榮，李祥華，張家均，等.六味地黃丸對甲狀腺功能亢進腎陰虛型小鼠cAMP、cGMP含量和Na+， K+-ATP酶活性的影響[J].中藥藥理與臨床，2011，27（6）：1-3.

[7] 傅萬山，丁伯平，楊? 解.六味地黃丸對甲亢型腎陰虛大鼠滋陰作用的研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2001，7（5）：16-18.

[8] 毛水龍，周衛(wèi)民，鄭怡健，等.六味地黃丸對甲狀腺素所致甲亢大鼠脂肪組織UCP2、骨骼肌UCP3mRNA表達的影響[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，22（11）：849-852.

[9] 張智敏，胡玉珍，熊蘇慧，等.玉竹水提醇沉上清液對甲亢陰虛型大鼠干預(yù)的GC-MS代謝組學(xué)研究[J].中國藥學(xué)雜志，2017，52（23）：2092-2097.

[10] 王? 強，李盛鈺，楊? 帆，等.玉竹中性多糖的分離純化及單糖組成分析[J].食品科學(xué)，2010，31（15）：100-102.

[11] 屈? 凱，曲? 鋒，樊雪紅，等.手心溫度與陰虛證、五心煩熱癥的相關(guān)性臨床研究[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2010，34（2）：134-135.

[12] STRICH D， KARAVANI G， EDRI S， et al. TSH enhancement of FT4 to FT3 conversion is age dependent[J]. Eur J Endocrinol， 2016， 175（1）： 49-54.

[13] WANG Q， REN X J， YAO S L， et al. Clinical observation on the endocrinal and immune functions in subjects with yin-deficiency constitution[J]. Chin J Integr Med， 2010， 16（1）： 28-32.

[14] 占阮娟，陳素紅，呂圭源，等.三味甘涼歸肺經(jīng)中藥對肺陰虛模型大鼠cAMP、cGMP的影響[J].中藥藥理與臨床，2012，28（6）：85-87.

[15] 王楠楠，戴明珠，徐俞悅，等.鐵皮石斛花對腎上腺皮質(zhì)激素致腎陰虛模型小鼠的影響[J].中藥藥理與臨床，2017，33（1）：116-119.

[16] 吳柳花，呂圭源，李? 波，等.黃精對長期超負(fù)荷游泳致陰虛內(nèi)熱模型大鼠的作用研究[J].中國中藥雜志，2014，39（10）：1886-1891.

[17] 林昌松，李? 寧，徐? 強，等.知柏養(yǎng)陰湯對陰虛模型大鼠糖脂代謝的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2011，22（10）：2404-2405.

[18] 張? 凡，徐? 珊，劉蓬蓬，等.黃柏不同炮制品對甲亢型腎陰虛模型大鼠甲狀腺和腎上腺皮質(zhì)功能的影響[J].中國藥房，2017，28（1）：27-30.

[19] 劉? 婷，候連兵，候毅成.甲狀腺片誘導(dǎo)的甲亢陰虛證大鼠模型的制備[J].中藥材，2008，31（9）：1402-1404.