賁晶晶 葛建彬 秦清清

摘要?目的：通過超高效液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜法測定杜仲的3種成分及其藥代動力學(xué)研究。方法：本研究的質(zhì)譜采用電噴霧電離源（ESI），通過多反應(yīng)離子監(jiān)測這一掃描方式對京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷等3種成分及內(nèi)標(biāo)用于定量分析的監(jiān)測離子。結(jié)果：1）杜仲中京尼平苷酸、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷等3個指標(biāo)性成分的分離良好，無內(nèi)源性物質(zhì)干擾，具有較好的專屬性。2）UPLC方法嚴(yán)謹(jǐn)性，其精密度、穩(wěn)定性試驗、重復(fù)性試驗、加樣回收率等均良好。3）京尼平苷酸和松脂醇二葡萄糖苷在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)具有非線性特征，僅綠原酸存在線性特征;而CLz、Vz參數(shù)指標(biāo)的差異比較大，顯示大鼠血漿中杜仲提取物中的3種成分在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)代謝過程不一致。結(jié)論：UPLC-MS/MS的操作簡單，結(jié)果具有較好的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性，可作為杜仲有效成分及藥代動力學(xué)研究的可靠方法。

關(guān)鍵詞?超高效液相色譜法;質(zhì)譜;杜仲;京尼平苷酸;綠原酸;松脂醇二葡萄糖苷;藥代動力學(xué);研究

Determination of 3 Components and Pharmacokinetics of Cortex Eucommiae by UPLC-MS

Ben Jingjing，Ge Jianbin，Qin Qingqing

（Pharmaceutical Department，Nantong Second People′s Hospital，Nantong 226002，China）

Abstract?Objective：To determine the 3 components of Cortex Eucommiae by ultra-high performance liquid chromatography combined with mass spectrometry and their pharmacokinetics.Methods：Electrospray ionization source（ESI）was used to monitor the monitoring ions of geniposide chlorogenic acid and terpineol diglucoside，and internal standards for quantitative analysis of geniposide chlorogenic acid and terpineol diglucoside.Results：1）The 3 index components of Cortex Eucommiae such as geniposide，chlorogenic acid and terpineol diglucoside，were well separated and had no interference of endogenous substances，with good specificity.2）The UPLC method was rigorous，and its precision，stability test，repeatability test and sample recovery rate were all good.3）The pharmacokinetics of geniposide and turpentine diglucoside in rats was nonlinear，but only chlorogenic acid was linear.However，there were significant differences in the 2 parameters of CLz and Vz，indicating that the pharmacokinetic metabolism of the 3 components of Cortex Eucommiae extract in rat plasma was inconsistent.Conclusion：The operation of UPLC-MS/MS is simple，and the results have good precision，stability and reproducibility.It can be used as a reliable method for the study of effective components and pharmacokinetics of Cortex Eucommiae.

Key Words?Ultra high performance liquid chromatography; Mass spectrometry; Cortex Eucommiae; Geniposide; Chlorogenic acid; Turpentine diglucoside; Pharmacokinetics; Study

中圖分類號：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.12.011

杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）為我國名貴滋補(bǔ)藥材，其取藥部位是樹皮，為杜仲科植物的干燥樹皮，別名木棉，從《神農(nóng)本草經(jīng)》上可見杜仲被列為上品，其味甘，性溫，主要治療功能有補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋壯骨、調(diào)理沖任、固經(jīng)安胎等[1-3]?？v觀杜仲2 000多年的藥用歷史，可知杜仲能夠治療腎陽虛引起的腰腿痛和（或）腰膝酸軟無力[4]，男性之陰囊濕癢[5]，女性之肝氣虛引起的胞胎不固[6-7]等癥。由現(xiàn)代藥理學(xué)研究可知[8]，杜仲中具有的降血壓[9-10]、抗腫瘤[11]、降血脂[12-13]、抗血栓[14]、抗氧化[15]等藥理作用是由哪些具體的成分發(fā)揮的功效，同時這些藥理成分的藥代動力學(xué)是如何變化的，因此課題組將杜仲提取物注射入大鼠尾靜脈后，研究杜仲的3個指標(biāo)性成分（分別是京尼平苷酸、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷）在大鼠體內(nèi)的具體經(jīng)時過程和藥代動力學(xué)參數(shù)特征，為臨床上使用杜仲這味藥物的前藥動學(xué)研究提供實驗依據(jù)。本課題研究主要采用UPLC-MS的技術(shù)手段，超高效液相色譜（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）是分離科學(xué)中的一個全新類別，UPLC是在高效液相色法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）的理論及原理的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，這一技術(shù)方法不僅秉承了HPLC的快速檢測手段，而且涵蓋了小顆粒填料進(jìn)一步提高也HPLC的精密度和靈敏度，同時以非常低系統(tǒng)體積增加分析通量和色譜峰容量[16]。通過以物質(zhì)離子化為基礎(chǔ)建立質(zhì)譜分析系統(tǒng)，測量并分析離子譜峰的強(qiáng)度來聯(lián)合分析杜仲3種成分，進(jìn)一步闡釋藥代動力學(xué)的經(jīng)時過程，首先杜仲提取物樣品經(jīng)過液相色譜純化后的樣品，再通過電場和磁場的綜合作用將樣品氣化離子化，形成的離子按照質(zhì)量數(shù)和電荷數(shù)的記錄并分析，在液相色譜質(zhì)譜中通常所用的離子源有電噴霧電離源（Electrospray Ionization，ESI）和大氣壓化學(xué)電離源（Atmospheric-Pressure Chemical Ionization，APCI），其中最常用的是ESI，根本原因是ESI比APCI軟電離程度較小的電離方式，因此在實際檢測應(yīng)用中適用范圍較APCI的大[17-18]?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1?儀器與試藥

1.1?儀器?ACQUITY UPLC超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Waters公司生產(chǎn)，產(chǎn)品型號：H-class-Xevo TQ MS）;冷凍高速離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)，產(chǎn)品型號：Allegra64-R）;氮吹儀（北京眾信佳儀科技有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品型號：ZX-DC）;渦旋混合器[萊普特科學(xué)儀器（北京）有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品型號：Vortex dancer Ⅳ];電子分析天平（上海精密儀器儀表公司生產(chǎn)，產(chǎn)品型號：FA1004N型）;超聲波清洗器（上海精密儀器儀表公司生產(chǎn)，產(chǎn)品型號：KQ-100DE）;超純水系統(tǒng)（法國MILIPORE公司生產(chǎn)，產(chǎn)品型號：Mili-RO Plus型）。

1.2?試劑?京尼平苷酸對照品（上海純優(yōu)生物科技有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號27741-01-1，藥品純度≥98%）;和綠原酸對照品（上海純優(yōu)生物科技有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號327-97-9，藥品純度≥98%）;松脂醇二葡萄糖苷對照品（上海順勃生物工程有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號201206，藥品純度≥98%）;葛根素對照品（中國藥品生物制品鑒定所生產(chǎn)，生產(chǎn)批號111-090623，藥品純度≥98%）。色譜純乙腈（美國Fisher公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號102489）和甲酸（美國Fisher公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號101437），AR級磷酸分析純（上海拓國滬試實驗室器材股份有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號20170412）。

1.3?分析樣品?杜仲藥材來源于湖北，經(jīng)過南通市第一人民醫(yī)院專業(yè)藥物研究人員鑒定為優(yōu)質(zhì)杜仲科植物杜仲的干燥樹皮，研究室以此為原材料自制杜仲提取物進(jìn)行進(jìn)一步研究。

1.4?實驗動物?動物清潔級SD大鼠，體質(zhì)量（260±20）g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供（批號2006A010），實驗室常規(guī)環(huán)境飼養(yǎng)。

2?方法與結(jié)果

2.1?色譜條件?進(jìn)樣體積為2 μL;色譜柱采用Waters-BEHC18（產(chǎn)品規(guī)格：采用窄徑柱2.1 mm，短柱100 mm，填料粒徑1.7 μm），色譜柱的溫度控制在45 ℃左右，進(jìn)樣器的溫度設(shè)置控制在15 ℃，流動相則以流動相A的主要試劑配置由0.1%甲酸和乙腈組成，流動相B的主要試劑配置由0.1%甲酸和水組成，以進(jìn)行梯度洗脫。具體的梯度洗脫程序見表1。

2.2?質(zhì)譜條件?本研究的質(zhì)譜采用ESI，首先設(shè)置毛細(xì)管電離電壓，經(jīng)過多個預(yù)實驗最終確定該電壓設(shè)置為3 kV，離子源溫度設(shè)置為120 ℃，并將氮氣作為本研究過程中涉及到的噴霧氣與反吹氣，并將反吹氣流速設(shè)置為50 L/h，而將氬氣作為本研究過程中涉及的碰撞氣，并將其流速設(shè)置為0.16 mL/min;去溶劑氣流速經(jīng)過多個預(yù)實驗最終確定該電壓設(shè)置為650 L/h，去溶劑氣溫度最終確定為350 ℃左右;通過多反應(yīng)離子監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）這一掃描方式對京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷等3種成分及內(nèi)標(biāo)用于定量分析的監(jiān)測離子。見表2。

2.3?對照品溶的配制?取4個裝有適量甲醇的廣口瓶用以配制濃度為1.35 mg/mL的京尼平苷酸、濃度為1.00 mg/mL的綠原酸、濃度為1.00 mg/mL的松脂醇二葡萄糖苷、濃度為1.00 mg/mL的葛根素的儲備液。其中葛根素是作為本研究的內(nèi)標(biāo)液，用甲醇按梯度稀釋成所需濃度，配制5 μg/mL的葛根素內(nèi)標(biāo)溶;同時分別精密量取京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷等3種對照品儲備液適量，用甲醇按梯度稀釋成所需濃度，得混合對照品溶液。

2.4?供試品溶液的配制?將杜仲用藥材剪剪成碎片，反復(fù)揉成絮狀，精密稱定2 g，采用索氏提取器中提取杜仲提取物，加入氯仿適量，加熱回流6 h，待冷卻后棄去氯仿液，藥渣室溫?fù)]發(fā)去氯仿，再將藥渣放置索氏提取器中進(jìn)一步提取，加甲醇適量，加熱回流6 h，待冷卻后將提取液轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶，加甲醇至刻度線，充分混合均勻搖勻即得杜仲供試品溶液。

2.5?血漿樣品處理方法?采用1.5 mL塑料離心管取大鼠血漿100 μL，加入已知濃度的葛根素內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，再加入等量的1%甲酸溶液和300 μL甲醇，渦旋混合器上混合1 min，超聲5 min，4 ℃低溫離心機(jī)上15 000 r/min離心10 min，取上清液并在48 ℃下的氮氣吹干，殘留物加入300 μL甲醇充分溶解，4 ℃低溫離心機(jī)上轉(zhuǎn)速采用15 000 r/min，離心時間控制在10 min以內(nèi)，最終只取上清液作為分析樣品進(jìn)樣UPLC-MS/MS分析。

2.6?杜仲提取物的專屬性試驗?如圖1所示，根據(jù)A空白血漿，B空白血漿+混合對照品溶液+內(nèi)標(biāo)，C含杜仲提取物大鼠血漿等3種情況對杜仲的3種成分及內(nèi)標(biāo)液進(jìn)行專屬性試驗，A、B、C 3種情況中的大鼠空白血漿、含杜仲提取物大鼠血漿均取100 μL，根據(jù)“2.5”依次操作得相應(yīng)UPLC-MS/MS色譜圖A、B、C;本研究結(jié)果顯示，杜仲提取物中可見分離程度良好的3種不同成分，且各個成分間不存在內(nèi)源性干擾物質(zhì)，具有較好的專屬性。

2.7?線性關(guān)系考察?根據(jù)梯度稀釋濃度配制混合對照品溶液100 μL的大鼠空白血漿作為標(biāo)準(zhǔn)參照曲線，縱坐標(biāo)Y是將含有大鼠杜仲提取物的待測血漿的峰面積除以葛根素內(nèi)標(biāo)峰面積得到的比值比值，橫坐標(biāo)X是京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷等各成分物質(zhì)濃度，將權(quán)重系數(shù)設(shè)置為1/X進(jìn)行計算直線回歸方程，京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷等3種成分最低檢測限（LLOD）定義為S/N≥3，結(jié)果顯示京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷均具有良好的線性關(guān)系，詳見表3。

2.8?精密度試驗?取統(tǒng)一批次含有杜仲提取物的大鼠血漿，按“2.5”項下分別配制京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷等3種成分大鼠血漿低、中、高3個濃度的質(zhì)量控制樣品（Quality Control，QC），通過3 d不間斷的連續(xù)測定，并根據(jù)每日測得的不同數(shù)據(jù)計算該日的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算求得3種成分當(dāng)日的平均濃度值，京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷等3種成分日內(nèi)和日間精密度RSD（%）均小于10%，準(zhǔn)確度范圍為95.473%～112.086%。表明該UPLC-MS/MS方法準(zhǔn)確度、日內(nèi)和日間精密度良好，結(jié)果見表4。

2.9?穩(wěn)定性試驗?按“2.7”項下分別配制京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷等3種成分，分別根據(jù)大鼠血漿低、中、高3個濃度的京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷等3種成分QC，對3種成分在室溫下放置6 h，4 ℃下冷藏8 h和凍融3次，通過在1 d內(nèi)重復(fù)測量多次來考察樣品的穩(wěn)定性。本研究結(jié)果表明含有杜仲提取物的大鼠血漿樣品中京尼平苷酸RSD=9.04%<15%、綠原酸RSD=10.12%<15%和松脂醇二葡萄糖苷RSD=8.83%<15%，提示本研究中含有杜仲提取物的大鼠血漿在UPLC的中具有較好的穩(wěn)定性。

2.10?重復(fù)性試驗?根據(jù)同一批次同一廠家的杜仲藥材制備制備6份杜仲供試品溶液，處理后分別進(jìn)樣測定，根據(jù)葛根素內(nèi)標(biāo)法計算得京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷的RSD分別為1.842%、2.018%、2.856%，表明本研究采用的UPLC方法重復(fù)性良好。

2.11?回收率試驗?精密量取大鼠空白血漿100 μL，按“2.7”項下分別配制京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷等3種成分的大鼠血漿或葛根素內(nèi)標(biāo)液，且分別配置低、中、高3個濃度的3種京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷QC，經(jīng)過反復(fù)測量5次，計算平均加樣回收率。京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷等3種成分回收率分別為：86.106%～96.461%，86.147%～99.828%，86.344%～96.679%，提示本研究中UPLC的加樣回收率良好。

2.12?樣品檢測結(jié)果?藥代動力學(xué)研究結(jié)果顯示：健康SD大鼠分為低、中、高3個劑量組，尾靜脈注射杜仲提取物溶液前所有大鼠均禁食12 h，期間可自由飲水，給藥劑量分別為0.17、0.34、0.68 g/kg。采用涂有肝素的塑料離心管于給藥前與給藥后2、5、10、15、20、30、45、60、80 min經(jīng)尾靜脈取血約0.3 mL，于離心機(jī)上采用4 500 r/min的轉(zhuǎn)速，離心時間控制在10 min。本研究采用UPLC-MS分析杜仲提取物的藥代動力學(xué)，并以DAS 2.0數(shù)據(jù)處理軟件數(shù)據(jù)擬合，本研究選取血藥濃度（AUC0-80）、平均駐留時間（MRT0-80）、清除率（CLz）、分布容積（Vz）等參數(shù)選用統(tǒng)計矩方法計算。獲得京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷3個成分C-t曲線圖和相應(yīng)的藥動學(xué)參數(shù)，具體詳細(xì)見圖2和表5。

3?討論

本次研究完成了京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷3種藥物成分的UPLC-MS/MS分析及其藥時曲線和藥代動力學(xué)的分析。研究前期主要從方法學(xué)的準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性和可重復(fù)性進(jìn)行考察，緊接著對京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷等3種成分的專屬性進(jìn)行鑒定，并進(jìn)一步對這3種成分進(jìn)行線性方程回歸和回收率的計算。而在藥代動力學(xué)的研究中，主要從低、中、高3個不同劑量濃度的杜仲提取物入手，建立體內(nèi)符合二室藥動學(xué)模型，進(jìn)而計算出大鼠血漿中杜中提取物內(nèi)3種成分的藥代動力學(xué)參數(shù)指標(biāo)。AUC0-80、MRT0-80都隨著濃度計量的升高而升高，從結(jié)果可得大鼠血漿中杜仲提取物中的3種成分中的京尼平苷酸和松脂醇二葡萄糖苷在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)具有非線性特征，僅綠原酸存在線性特征;而CLz、Vz參數(shù)指標(biāo)的差異比較大，顯示大鼠血漿中杜仲提取物中的3種成分在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)代謝過程不一致。本研究中前期在考察大鼠血漿樣品的處理優(yōu)化方法過程中，首先從溶劑入手，對甲醇、乙腈、乙酸乙酯，乙醚4種不同的有機(jī)溶劑對大鼠血漿中的蛋白進(jìn)行沉淀，結(jié)果顯示，對大鼠血漿中蛋白的沉淀效果最好的有機(jī)溶劑是甲醇，而在進(jìn)一步的研究中更發(fā)現(xiàn)甲醇不僅無內(nèi)源性物質(zhì)干擾而且回收率最好，因此本研究最終選擇甲醇沉淀處理大鼠血漿樣品。在提取方法的選擇上，以京尼平苷酸、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷3種成分作為考察指標(biāo)，對提取溶劑進(jìn)行考察：取樣品2 g 3份，分別精密加入甲醇，80%甲醇，50%甲醇25 mL，超聲6 h。結(jié)果表明：用80%甲醇提取的京尼平苷酸、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷3種成分均得到較高的含量，所以本研究最終選用80%甲醇作為杜仲提取物成分的提取溶劑。對提取方式及時間進(jìn)行考察：取樣品2 g 6份，精密加入80%甲醇25 mL，取其中3份回流，提取時間分別為2 h、4 h、6 h;取另外3份超聲，提取時間分別為2 h、4 h、6 h。結(jié)果表明，回流和超聲2種提取方式對含量結(jié)果影響不大，因超聲操作較為簡便，且6 h能將京尼平苷酸、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷等3種成分提取完全，故選擇超聲處理。

綜上所述，采用超高效液相色譜法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，加樣回收率高，可用于研究杜仲的3個指標(biāo)性成分在體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征，考察3個指標(biāo)成份在大鼠體內(nèi)的經(jīng)時過程，并記錄3個指標(biāo)成分的動力學(xué)參數(shù)，為研究杜仲臨床前藥動學(xué)研究提供實驗依據(jù)。

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（2018-12-11收稿?責(zé)任編輯：楊陽）