彭臻菲 李泳寧 魏碧娜 林碧珠

摘要：[目的]研究海帶多糖對(duì)HO誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）增殖及胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物生成量的影響，為闡明海帶多糖對(duì)VSMC的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。[方法]以HO為誘導(dǎo)劑建立體外VSMC增殖模型，通過(guò)四甲基偶氮唑鹽法和細(xì)胞形態(tài)觀察評(píng)價(jià)海帶多糖對(duì)HO誘導(dǎo)VSMC生長(zhǎng)和增殖的影響，同時(shí)以丙二醛為指標(biāo)考察海帶多糖對(duì)HO誘導(dǎo)VSMC胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物生成量的影響。[結(jié)果]以50umol·L-1HO為誘導(dǎo)劑建立VSMC體外增殖模型。四甲基偶氮唑鹽法測(cè)定結(jié)果表明海帶多糖對(duì)HO誘導(dǎo)VSMC增殖具有顯著抑制活性，最大增殖抑制率達(dá)到73.56%。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明海帶多糖作用下HO誘導(dǎo)的VSMC生長(zhǎng)狀態(tài)發(fā)生改變且細(xì)胞數(shù)量顯著減少。丙二醛檢測(cè)結(jié)果表明海帶多糖作用下VSMC胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物量顯著減少。[結(jié)論]海帶多糖能夠抑制HO誘導(dǎo)的VSMC增殖，且顯著降低VSMC胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物生成量。

關(guān)鍵詞：海帶多糖;血管平滑肌細(xì)胞;HO誘導(dǎo);細(xì)胞增殖;脂質(zhì)過(guò)氧化物

中圖分類號(hào)：P745文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-0384（2019）12-1457-06

0 引言

[研究意義]近年來(lái)，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展與人們生活水平提升，心血管疾病發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，已嚴(yán)重威脅人類健康。動(dòng)脈粥樣硬化是心血管系統(tǒng)疾病中最常見(jiàn)的疾病之一，也是心血管疾病共同的病理基礎(chǔ)。積極預(yù)防和控制動(dòng)脈粥樣硬化是預(yù)防心血管疾病、降低疾病發(fā)病率的重要手段。（前人研究進(jìn)展）病理學(xué)研究結(jié)果表明，VSMC增殖是早期動(dòng)脈粥樣硬化形成的始動(dòng)環(huán)節(jié)之一，成為心血管疾病防治研究的重要靶細(xì)胞。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)，活性氧自由基（reactiveoxygenspecies，ROS）與VSMC增殖相關(guān)。血管緊張素Ⅱ、高糖等通過(guò)提高VSMC胞內(nèi)ROS水平促進(jìn)細(xì)胞增殖?？寡趸瘎┱{(diào)控ROS介導(dǎo)信號(hào)通路抑制VSMC增殖。因此，以ROS清除劑篩選VSMC增殖抑制劑成為研究方向之一。[本研究切入點(diǎn)]海帶是我國(guó)東南沿海常見(jiàn)的經(jīng)濟(jì)型養(yǎng)殖海藻，具有藥食同源性，在我國(guó)多部古代醫(yī)學(xué)典籍中均有記載其藥學(xué)功效。多糖是海帶主要的藥效學(xué)活性成分，動(dòng)物學(xué)試驗(yàn)研究結(jié)果表明，海帶多糖可有效降低試驗(yàn)性大鼠血管脂質(zhì)沉積，降低動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)海帶多糖具有清除超氧陰離子（O·）活性，且抑制堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）誘導(dǎo)VSMC增殖。已有研究發(fā)現(xiàn)HO通過(guò)調(diào)控O·導(dǎo)信號(hào)通路促進(jìn)VSMC增殖。但是海帶多糖對(duì)VSMC增殖抑制活性與其抗氧化活性相關(guān)性研究未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。[擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題]因此，本課題以氧化劑HO為誘導(dǎo)劑建立VSMC體外增殖模型，研究海帶多糖對(duì)氧化劑誘導(dǎo)VSMC增殖及胞內(nèi)過(guò)氧化物生成影響，為闡明海帶多糖對(duì)VSMC的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 原料

海帶多糖由本實(shí)驗(yàn)室制備，多糖含量為87.2%;DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;胎牛血清（FBS）購(gòu)自杭州四季青;丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司;二甲基亞砜（DMSO）、HO購(gòu)自Sigma公司;動(dòng)物細(xì)胞裂解液購(gòu)自上海生工;MTT購(gòu)自Biosharp公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2主要儀器設(shè)備

BCM-1000超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司;HERAcell 150i CO恒溫培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司;TGL-16M冷凍離心機(jī)，湖南湘儀;P10-Y超純水系統(tǒng)，科爾頓有限公司;M3酶標(biāo)分析儀，美國(guó)MD公司;TS-100F倒置顯微鏡，日本尼康公司;UV-2600紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) VSMC由本實(shí)驗(yàn)室制備。細(xì)胞培養(yǎng)及傳代：VSMC采用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5%CO培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合后，吸棄培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，PBS緩沖液清洗細(xì)胞瓶，加入適量0.25%胰酶，37℃放置3min，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞呈懸浮，即加入完全培養(yǎng)液終止酶解反應(yīng)。吸管反復(fù)輕輕吹打培養(yǎng)液以分散細(xì)胞團(tuán)，取0.5mL細(xì)胞懸液接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)加新鮮的完全培養(yǎng)液至3mL。置于37℃、5%CO培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

1.3.2HO誘導(dǎo)VSMC增殖模型構(gòu)建 取濃度為1×10個(gè)mL-1VSMC懸液接種96孔板，37℃、5%CO培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24h，待細(xì)胞完全貼壁后，用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液37℃孵育8h。加入HO溶液于96孔板至終濃度為設(shè)定濃度，對(duì)照組用無(wú)血清DMEM代替HO。孵育至12h、24h、36h后加入MTT溶液（100ug·孔），孵育4h后，棄上清液，加入DMSO（200uL·孔）。振蕩混勻，于578nm下檢測(cè)吸光值。每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)定6孔平行孔。細(xì)胞增殖率計(jì)算公式：

式中：A為HO模型組吸光值;Ao為對(duì)照組吸光值。

1.3.3MTT法測(cè)定VSMC增殖取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞懸液（1×10個(gè)·mL）接種于96孔培養(yǎng)板中，200uL孔，待細(xì)胞貼壁后更換無(wú)血清培養(yǎng)液，37℃、5%CO培養(yǎng)箱內(nèi)靜置過(guò)夜培養(yǎng)。吸棄培養(yǎng)液，向96孔板內(nèi)分別加入0.1、0.5、1.o mg·mL海帶多糖樣品，每個(gè)濃度樣品設(shè)置6個(gè)平行孔，HO模型組用DMEM代替多糖樣品。培養(yǎng)至設(shè)定時(shí)間后，向各孔分別加入HO，繼續(xù)孵育至設(shè)定時(shí)間，加入MTT溶液（100ug·孔），孵育4h后，棄上清液，加入DMSO（200uL·孔）。振蕩混勻，于578nm下檢測(cè)吸光值。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式：

式中：A為HO模型組的吸光值;A為海帶多糖試驗(yàn)組吸光值。

1.3.4VSMC形態(tài)觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞懸液（1×10cells·mL）接種于6孔培養(yǎng)板中，1mE·孔，待細(xì)胞貼壁后更換無(wú)血清培養(yǎng)液，37℃、5%CO培養(yǎng)箱內(nèi)靜置過(guò)夜培養(yǎng)。吸棄培養(yǎng)液，向6孔板內(nèi)分別加入0.5、1.0mg·mL海帶多糖樣品，每個(gè)濃度樣品設(shè)置3個(gè)平行孔，HO，模型組用DMEM代替多糖樣品。培養(yǎng)至設(shè)定時(shí)間后，向各孔分別加入HO，繼續(xù)孵育至設(shè)定時(shí)間后于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.5MDA含量測(cè)定按1.3.4方法處理細(xì)胞，待細(xì)胞經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)液過(guò)夜饑餓處理后吸棄培養(yǎng)液，向6孔板內(nèi)分別加入0.1、0.5、1.0mg·mL海帶多糖樣品，每個(gè)濃度樣品設(shè)置3個(gè)平行孔，HO模型組用DMEM代替多糖樣品。培養(yǎng)至設(shè)定時(shí)間后，向各孔分別加入HO，繼續(xù)孵育至設(shè)定時(shí)間后收集細(xì)胞，按碧云天MDA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明操作，于532nm下測(cè)定吸光值，并計(jì)算MDA含量。

1.3.6數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HO誘導(dǎo)VSMC體外增殖模型的建立

本課題以HO為誘導(dǎo)劑建立VSMC體外增殖模型，結(jié)果如表1所示。在相同的HO濃度下，24h試驗(yàn)組VSMC增殖率均高于12h和48h試驗(yàn)組。而在HO相同作用時(shí)間下，VSMC增殖率均隨著HO濃度的增加呈先上升而后下降的趨勢(shì)。在HO濃度為10～100～rnol·L時(shí)，VSMC增殖率隨著HO濃度增高而增大。當(dāng)時(shí)間為24h，HO濃度為50gmol·L時(shí)，VSMC增殖率達(dá)到142.54%，再增加HO濃度至100umol·L，其VSMC增殖率略有增加，但與50umol·L試驗(yàn)組相比，差異并不顯著。而當(dāng)HO濃度增加至150umol·L，其VSMC增殖率則有所下降?？梢?jiàn)當(dāng)HO濃度增大至150lamol·L對(duì)VSMC具有細(xì)胞毒性，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致。因此，本課題選擇HO誘導(dǎo)VSMC增殖處理濃度為50umol·L，作用時(shí)間為24h。

2.2 海帶多糖對(duì)VSMC增殖作用的影響

采用MTT法測(cè)定海帶多糖對(duì)VSMC增殖影響，結(jié)果見(jiàn)圖1所示。從圖1可以看出，海帶多糖預(yù)處理時(shí)間相同時(shí)，隨著海帶多糖預(yù)處理質(zhì)量濃度的增加VSMC增殖抑制率增大，呈量效相關(guān)性。在相同海帶多糖預(yù)處理時(shí)間下，與海帶多糖預(yù)處理質(zhì)量濃度為0.1mg·mL-1試驗(yàn)組相比，海帶多糖預(yù)處理質(zhì)量濃度為0.5mg·mL和1.0mg·mL試驗(yàn)組VSMC增殖抑制率均顯著增高（P<0.05）。當(dāng)海帶多糖預(yù)處理時(shí)間為12h時(shí)，質(zhì)量濃度為1.0mg·mL海帶多糖預(yù)處理試驗(yàn)組VSMC增殖抑制率為53.11%，是相同多糖預(yù)處理時(shí)間下0.1mg·mL海帶多糖預(yù)處理試驗(yàn)組的5.72倍。由此可見(jiàn)，海帶多糖可抑制氧化劑HO誘導(dǎo)VSMC增殖。

同時(shí)，由圖l可以看出，當(dāng)海帶多糖預(yù)處理質(zhì)量濃度高于0.5mg·mL時(shí)，與多糖預(yù)處理時(shí)間12h試驗(yàn)組相比，多糖預(yù)處理時(shí)間為24h和48h試驗(yàn)組VSMC增殖抑制率均顯著增高（P<0.05），增殖抑制率均達(dá)到60%。其中，當(dāng)海帶多糖預(yù)處理質(zhì)量濃度為1.0mg·mL時(shí)，多糖預(yù)處理時(shí)間為24h試驗(yàn)組VSMC增殖抑制率最大，達(dá)73.56%。因此，后續(xù)試驗(yàn)選擇海帶多糖預(yù)處理時(shí)間為24h。

2.3 海帶多糖對(duì)VSMC形態(tài)影響

由圖2可知，HO模型組細(xì)胞透光性強(qiáng)，細(xì)胞邊緣模糊，細(xì)胞呈伸展的梭狀，且細(xì)胞密度大。海帶多糖預(yù)處理試驗(yàn)組VSMC形態(tài)則出現(xiàn)顯著變化，0.5mg·mL海帶多糖預(yù)處理試驗(yàn)組VSMC數(shù)目減少，且細(xì)胞胞質(zhì)回縮，部分細(xì)胞呈圓形。1mg·mL海帶多糖預(yù)處理試驗(yàn)組VSMC密度顯著降低，細(xì)胞邊緣清晰，細(xì)胞胞質(zhì)回縮，鏡下可見(jiàn)大部分細(xì)胞呈圓形。由此可見(jiàn)，海帶多糖可引起VSMC生長(zhǎng)形態(tài)改變，隨著海帶多糖預(yù)處理濃度的增高，VSMC數(shù)量顯著減少，且呈圓形的VSMC數(shù)量增多，表明海帶多糖預(yù)處理后VSMC形態(tài)發(fā)生顯著變化，使其增殖速度減慢。

2.4 海帶多糖對(duì)HO誘導(dǎo)VSMC胞內(nèi)MDA生成的影響

研究發(fā)現(xiàn)，HO誘導(dǎo)VSMC胞內(nèi)大量累積ROS可促進(jìn)VSMC胞內(nèi)一系列脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的生成，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞釋放生長(zhǎng)因子促使VSMC增殖，因此脂質(zhì)過(guò)氧化物是評(píng)估VSMC胞內(nèi)ROS水平的重要參數(shù)。本課題以MDA表征胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物生成量，結(jié)果如表2所示。

從表2中可以看出，與對(duì)照組相比，HO模型組MDA含量顯著提高，達(dá)到3.21umol·L，表明HO誘導(dǎo)VSMC胞內(nèi)生成大量脂質(zhì)過(guò)氧化物，ROS水平顯著提高，這是其誘導(dǎo)VSMC增殖的重要因素。而采用不同質(zhì)量濃度海帶多糖進(jìn)行預(yù)處理后，其VSMC胞內(nèi)MDA生成量均有下降。當(dāng)海帶多糖質(zhì)量濃度達(dá)到1.0mg·mL時(shí)，VSMC胞內(nèi)MDA生成量最低，僅為1.27umol-L，與HO模型組相比下降了60.44%。由此可見(jiàn)，VSMC胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物生成量隨著海帶多糖預(yù)處理濃度的增加而降低，呈量效相關(guān)陸，表明海帶多糖預(yù)處理后有效抑制VSMC胞內(nèi)因HO誘導(dǎo)引起的ROS升高，提示海帶多糖對(duì)HO誘導(dǎo)VSMC增殖的抑制機(jī)制與調(diào)控VSMC胞內(nèi)ROS水平相關(guān)。因此，后續(xù)試驗(yàn)可進(jìn)一步從分子水平探討海帶多糖對(duì)VSMC胞內(nèi)ROS的調(diào)控機(jī)制，闡明海帶多糖對(duì)HO誘導(dǎo)VSMC增殖抑制機(jī)制。

3討論與結(jié)論

病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，血管平滑肌細(xì)胞異常增殖是動(dòng)脈粥樣硬化形成的始動(dòng)環(huán)節(jié)，也是動(dòng)脈粥樣硬化心血管疾病共同的病理基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)抗動(dòng)脈粥樣硬化活性物質(zhì)西洛他唑通過(guò)阻斷VSMC胞內(nèi)ERK1/2信號(hào)通路，抑制VSMC增殖。Bin等對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化形成分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化重要誘因氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)VSMC胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子KLF5表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)胞內(nèi)微小RNA-29a表達(dá)水平，最終促進(jìn)VSMC增殖而形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，ROS水平增高激活VSMC胞內(nèi)MAPK信號(hào)通路并促進(jìn)VSMC增殖。Yang等研究結(jié)果表明高糖處理引起細(xì)胞ROS水平增高是其誘導(dǎo)VSMC增殖的主要因素。因此，胞內(nèi)ROS水平增高是VSMC增殖的促進(jìn)因子。

天然產(chǎn)物活性研究結(jié)果表明，海藻多糖具有顯著抗氧化活性，可有效降低胞內(nèi)ROS水平。馬軍等研究發(fā)現(xiàn)海藻多糖具有自由基清除和抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性。楊運(yùn)高等用大鼠紅細(xì)胞免疫功能缺陷模型研究海藻多糖對(duì)紅細(xì)胞免疫功能及自由基損傷的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示，海藻多糖增強(qiáng)超氧化物歧化酶、谷胱甘肽等還原性物質(zhì)活性，并降低MDA含量，表明海藻多糖可降低大鼠體內(nèi)ROS水平，是抗氧化劑的重要備選資源。海帶多糖是一種抗氧化活性顯著的海藻多糖，其對(duì)DPPH、羥自由基、超氧陰離子等自由基的清除活性顯著。張晴嵐等研究發(fā)現(xiàn)海帶多糖可改善大鼠血脂水平，提高一氧化氮濃度和一氧化氮合酶活性，抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)生和發(fā)展。本課題以HO為誘導(dǎo)劑建立VSMC增殖模型，評(píng)估海帶多糖作用下動(dòng)脈粥樣硬化始動(dòng)因子VSMC生長(zhǎng)與脂質(zhì)過(guò)氧化水平的相關(guān)性。結(jié)果表明，海帶多糖可抑制HO誘導(dǎo)VSMC增殖且呈量效相關(guān)性。而海帶多糖濃度與VSMC胞內(nèi)MDA含量呈負(fù)相關(guān)性，可見(jiàn)海帶多糖緩解了VSMC胞內(nèi)因HO誘導(dǎo)引起的ROS水平增高，表明海帶多糖抑制VSMC增殖與其抗氧化活性相關(guān)。因此，后續(xù)研究需進(jìn)一步從ROS調(diào)控細(xì)胞增殖的MAPK通路上進(jìn)一步探討海帶多糖對(duì)VSMC增殖的抑制機(jī)制，為深度開(kāi)發(fā)海帶藥用價(jià)值奠定基礎(chǔ)。