邵樂(lè) 夏相宜 王宇紅 蔡光先 佘顏

〔摘要〕 目的 觀(guān)察補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方對(duì)氧化應(yīng)激損傷后血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，并從核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子/抗氧化反應(yīng)元件（NF-E2-related factor 2/ antioxidant response element，Nrf2/ARE）途徑探討其作用機(jī)制。方法 采用H2O2作用大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞4 h建立體外血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，根據(jù)不同處理分成正常組，模型組，補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清組（補(bǔ)陽(yáng)組），補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方含藥血清組（5%精簡(jiǎn)組、10%精簡(jiǎn)組、20%精簡(jiǎn)組）6組。采用倒置顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)亡;測(cè)定細(xì)胞SOD活力、MDA含量;采用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞Nrf2、血紅素加氧酶-1（HO-1）蛋白的表達(dá)。結(jié)果 與模型組比較，含藥血清組均能不同程度改善細(xì)胞形態(tài)，升高細(xì)胞存活率，其中10%精簡(jiǎn)組較5%精簡(jiǎn)組、20%精簡(jiǎn)組細(xì)胞損傷程度低;與模型組比較，補(bǔ)陽(yáng)組和10%精簡(jiǎn)組可有效抑制細(xì)胞凋亡 （P<0.05）;與模型組比較，補(bǔ)陽(yáng)組及10%精簡(jiǎn)組可顯著提升SOD活力（P<0.01）;補(bǔ)陽(yáng)組、10%精簡(jiǎn)組及20%精簡(jiǎn)組可降低MDA含量（P<0.05）;補(bǔ)陽(yáng)組及10%精簡(jiǎn)組可明顯上調(diào)Nrf2、HO-1蛋白表達(dá) （P<0.05）。結(jié)論 10%補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方可以顯著減輕氧化應(yīng)激造成血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，抑制細(xì)胞調(diào)亡，這一作用可能與上調(diào)Nrf2/ARE抗氧化信號(hào)通路途徑表達(dá)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方;氧化應(yīng)激;血管內(nèi)皮細(xì)胞;核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2;血紅素加氧酶-1

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R285.5;R393? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.02.004

有研究表明，氧化應(yīng)激造成的內(nèi)皮細(xì)胞損傷在缺血性腦損害中起關(guān)鍵作用，是造成腦缺血/再灌注不可逆損傷的主要因素[1-2]。轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子/抗氧化反應(yīng)元件（NF-E2-related factor 2/antioxidant response element，Nrf2/ARE）抗氧化信號(hào)通路是機(jī)體重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，在內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮重要調(diào)控作用[3]。因此，研究氧化應(yīng)激對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷機(jī)制，并以此為靶點(diǎn)尋找保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的有效藥物，對(duì)缺血性腦血管疾病的防治具有重要意義。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方是課題組在多年臨床經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，遵循補(bǔ)陽(yáng)還五湯之方義，基于益氣祛瘀生新法精簡(jiǎn)方藥，并且配合醇提、超臨界CO2提取工藝制備而成。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方通過(guò)調(diào)控Nrf2/ARE信號(hào)通路發(fā)揮抗腦缺血的作用[4]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀(guān)察該方對(duì)氧化應(yīng)激損傷后血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料

1.1? 細(xì)胞和動(dòng)物

大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞株（bEnd.3細(xì)胞株）由長(zhǎng)沙唯爾生物技術(shù)有限公司提供。SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量250～280 g，雄性，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。

1.2? 藥材

補(bǔ)陽(yáng)還五湯處方（生黃芪120 g，當(dāng)歸尾6 g，川芎3 g，紅花3 g，赤芍4.5 g，桃仁3 g，地龍3 g）和補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方處方（黃芪30 g，川芎9 g，地龍6 g），補(bǔ)陽(yáng)還五湯按傳統(tǒng)水煎后濃縮干燥制備成干浸膏（每1 g干浸膏相當(dāng)于原生藥4.5 g），補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方采用醇提、超臨界CO2提取工藝制備干浸膏（每1 g干浸膏相當(dāng)于原生藥4.7 g），以上干浸膏均由湖南中醫(yī)藥研究院中藥所提供。

1.3? 主要試劑和儀器

DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone公司）;胎牛血清（Gibco公司）;MTT（Sigma公司）;Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物有限公司）;SOD試劑盒、MDA試劑盒（南京建成生物工程研究所）;兔抗大鼠Nrf2多克隆抗體、兔抗大鼠血紅素加氧酶-1（HO-1）多克隆抗體（Abcam公司）;兔抗大鼠GAPDH 多克隆抗體（上海拜力生物科技有限公司）。YT-CJ-2NB型超凈工作臺(tái)（北京亞泰科隆公司）;DSZ2000X型倒置生物顯微鏡（北京中顯恒業(yè)儀器儀表有限公司）;MB-530型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（深圳匯松有限公司）;FACSAriaII型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）;Bx51光學(xué)顯微鏡及IPP6.0圖像分析系統(tǒng)（日本Olympus公司）;MK3酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃公司）;mini protean 3 cell電泳儀（美國(guó)BIO-RAD公司）。

2 方法

2.1? 含藥血清制備

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為補(bǔ)陽(yáng)組、精簡(jiǎn)方組和對(duì)照組，每組5只。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)研究[5]，藥物組予以相當(dāng)于人臨床用量的6倍劑量給藥，補(bǔ)陽(yáng)組大鼠劑量換算后約為18 g/（kg·d），精簡(jiǎn)組大鼠劑量換算后約12 g/（kg·d），正常組用等容量生理鹽水。均為每天2次，連續(xù)灌胃7 d。于末次灌胃2 h后，無(wú)菌條件下，腹主動(dòng)脈取血，3 500 r/min，離心20 min，取上清，56 ℃滅活30 min，0.22 μm微膜濾過(guò)除菌后，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2? 細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，單層融合達(dá)80%左右，胰酶消化細(xì)胞，一分為二進(jìn)行細(xì)胞傳代。待狀態(tài)穩(wěn)定后移至96孔培養(yǎng)板上，分組實(shí)驗(yàn)。

2.3? 細(xì)胞分組和處理

取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞生長(zhǎng)至密度90%左右，接種于96孔培養(yǎng)板中，37 ℃、5%C02培養(yǎng)。將補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清配制成10%濃度，而補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方含藥血清配制成5%、10%、20% 3個(gè)濃度。采用300 μmol/L的H2O2作用血管內(nèi)皮細(xì)胞4 h建立細(xì)胞氧化應(yīng)激模型。細(xì)胞設(shè)6組：（1）正常組;（2）H2O2模型組;（3）補(bǔ)陽(yáng)組（H2O2模型+10%補(bǔ)陽(yáng)含藥血清）;（4）5%精簡(jiǎn)組（H2O2模型+5%補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方含藥血清）;（5）10%精簡(jiǎn)組（H2O2模型+10%補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方含藥血清）;（6）20%精簡(jiǎn)組（H2O2模型+20%補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方含藥血清）。將細(xì)胞與藥物共同作用2 h后，3 000 r/min離心后，收集各組細(xì)胞上清液進(jìn)行檢測(cè)。

2.4? 形態(tài)學(xué)觀(guān)察

將各組細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀(guān)察各組細(xì)胞形態(tài)變化，并拍片記錄。

2.5? 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

將收集的各組細(xì)胞置于PBS中洗滌2次，2 000 r/min下離心5 min，收集1×105～5×105細(xì)胞;加入 500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞;加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻;室溫、避光、反應(yīng)5～15 min;在1 h內(nèi)，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行觀(guān)察和檢測(cè)。

2.6? 細(xì)胞 SOD 活力和MDA 含量的檢測(cè)

按“2.3”中的分組進(jìn)行相應(yīng)處理后，收集細(xì)胞，離心收集上清液。采用專(zhuān)用試劑盒檢測(cè)SOD活力和MDA含量，按試劑盒檢測(cè)說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作。

2.7? 細(xì)胞Nrf2、HO-1的蛋白表達(dá)的檢測(cè)

將裂解液融化、分裝，離心得到蛋白抽提物，并用BCA法定量。備膠、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。加入一抗4 °C孵育過(guò)夜，一抗包括兔抗大鼠Nrf2（1∶600），兔抗大鼠HO-1（1∶600），洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶4 000）孵育，用ECL系統(tǒng)進(jìn)行發(fā)光和觀(guān)察。采用美國(guó)BioRad公司生產(chǎn)Quantity one 4.5.0.軟件系統(tǒng)分析各條帶的灰度值，記錄每條蛋白電泳帶的灰度值與相應(yīng)的內(nèi)對(duì)照GAPDH灰度值的比值， 進(jìn)行定量分析。

2.8? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均經(jīng)過(guò)方差齊性檢驗(yàn)和正態(tài)性檢驗(yàn)，計(jì)量資料用“x±s”表示，相同時(shí)間點(diǎn)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 形態(tài)學(xué)觀(guān)察

正常組血管內(nèi)皮細(xì)胞飽滿(mǎn)，大小均勻，胞核比較清晰，細(xì)胞呈鋪路石樣緊密排列。H2O2模型組細(xì)胞呈多角形，輪廓不清晰，核周?chē)梢?jiàn)深色顆粒，同時(shí)可見(jiàn)一些細(xì)胞碎片，細(xì)胞存活率較正常組明顯降低，含藥血清處理組細(xì)胞存活率不同程度升高，其中10%精簡(jiǎn)組含藥血清處理組較5%、20%精簡(jiǎn)組細(xì)胞損傷程度低。

3.2? 不同含藥血清對(duì)H2O2處理血管內(nèi)皮細(xì)胞后細(xì)胞凋亡的影響

相較于正常組，模型組細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象（P<0.01）。補(bǔ)陽(yáng)組和10%精簡(jiǎn)組抑制凋亡的效果明顯，凋亡率與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

3.3? 不同含藥血清對(duì)H2O2處理血管內(nèi)皮細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)SOD 活力、MDA 含量的影響

與正常組比較，模型組SOD活力明顯降低（P<0.01），MDA含量顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，補(bǔ)陽(yáng)組及10%精簡(jiǎn)組能升高SOD活力（P<0.01），降低MDA含量（P<0.05）。見(jiàn)表2。

3.4? 不同含藥血清對(duì)H2O2處理血管內(nèi)皮細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)Nrf2、HO-1蛋白的影響

正常組中Nrf2、HO-1蛋白呈少量表達(dá)，模型組Nrf2蛋白表達(dá)與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。補(bǔ)陽(yáng)組及10%精簡(jiǎn)組明顯上調(diào)Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)，與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。表3。

4 討論

正常血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)上緊密相連，在維持血管壁通透性完整、保持血管舒張收縮平衡、抗血栓形成及減輕血管炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是缺血性腦血管疾病病理學(xué)基礎(chǔ)，在眾多損傷因素中，氧化應(yīng)激反應(yīng)是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的始動(dòng)因素和關(guān)鍵環(huán)節(jié)，干預(yù)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷已成為治療心腦血管疾病的主要途經(jīng)[6-8]。

Nrf2/ARE抗氧化信號(hào)通路是機(jī)體重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，Nrf2屬于CNC（cap-n-collar）轉(zhuǎn)錄因子家族成員，該因子在生理狀態(tài)下與Keap1 結(jié)合處于失活狀態(tài)，氧化應(yīng)激刺激Nrf2與 Keap1解偶聯(lián)并在多種蛋白激酶的磷酸化作用下，Nrf2 進(jìn)入細(xì)胞核與抗氧化反應(yīng)元件（ARE） 結(jié)合，啟動(dòng) HO-1 基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮強(qiáng)大的抗氧化作用。有研究表明Nrf2/ARE抗氧化信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子Nrf2、HO-1參與不同來(lái)源氧自由基誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[9-11]。

體外氧化應(yīng)激細(xì)胞模型成功建立是從細(xì)胞分子基因水平研究缺血缺氧性損傷的前提，其能準(zhǔn)確模擬體內(nèi)腦缺血時(shí)自由基增多這一環(huán)境，有助于研究腦缺血后氧化應(yīng)激機(jī)制以及抗氧化應(yīng)激藥物的作用靶點(diǎn)。本文采用H2O2作用血管內(nèi)皮細(xì)胞模擬氧化應(yīng)激條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[12-13]，實(shí)驗(yàn)表明：在H2O2刺激下， 細(xì)胞明顯損傷，這種損傷變化可能與SOD 活力降低、MDA含量升高有關(guān)，提示氧化應(yīng)激加劇內(nèi)皮細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。同時(shí)，氧化應(yīng)激刺激Nrf2/ARE抗氧化信號(hào)通路中關(guān)鍵分子Nrf2及HO-1表達(dá)增多，從而發(fā)揮抗氧化效應(yīng)。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯為已證實(shí)可有效抑制早期神經(jīng)功能惡化[14]，且P13K-Akt信號(hào)通路的調(diào)控可能是關(guān)鍵機(jī)制之一[15]。補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方由黃芪、川芎等組成，遵循補(bǔ)陽(yáng)還五湯之方義，秉承“瘀血不去，新血不生”和“不破不立，瘀祛新生”的觀(guān)念而組方，并且配合醇提、超臨界CO2提取工藝制備，以組建一種物質(zhì)基礎(chǔ)明確、藥效相當(dāng)甚至更優(yōu)于原方的新型復(fù)方。本實(shí)驗(yàn)將不同濃度（5%、10%、20%）的補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方含藥血清與H2O2損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果10%補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方含藥血清能明顯促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，且顯著提高SOD活性，降低MDA含量，提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方通過(guò)增強(qiáng)脂質(zhì)抗氧化酶活性而拮抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而發(fā)揮對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用。10%補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方含藥血清能上調(diào) Nrf2-ARE信號(hào)通路中Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)，推測(cè)補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方可激活內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，進(jìn)而增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷能力，進(jìn)一步豐富了補(bǔ)陽(yáng)還五湯抗氧化應(yīng)激的作用機(jī)制。

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