李慧丹 趙文鴿 王學(xué)惠

摘要：同型半胱氨酸（Hcy）是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子之一。Hcy能夠誘導(dǎo)細(xì)胞活性氧（ROS）的生成增多引起內(nèi)皮損傷從而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化（AS）發(fā)生發(fā)展。內(nèi)皮細(xì)胞中ROS主要來(lái)源于Nox4（NADPH oxidases 4）。NLRP3在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化及主動(dòng)脈硬化中高表達(dá)。NLRP3是AS中IL-1家族細(xì)胞因子產(chǎn)生的關(guān)鍵介質(zhì)，特別是當(dāng)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的大量ROS，可導(dǎo)致caspase-1前體大量剪切成具有生物活性的caspase-1 P10片段，推動(dòng)下游IL-1β和IL-18等炎癥因子的成熟及分泌，使內(nèi)皮細(xì)胞功能受損，引起細(xì)胞炎癥損傷及凋亡，正反饋加重血管損傷。本文主要探討Nox4在Hcy介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥及凋亡的作用，Hcy導(dǎo)致的AS提供可能的機(jī)制。

關(guān)鍵詞：同型半胱氨酸;動(dòng)脈粥樣硬化;Nox4;NLRP3

中圖分類號(hào)：R543.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.15.015

文章編號(hào)：1006-1959（2019）15-0045-03

Abstract：Homocysteine （Hcy） is one of the independent risk factors for cardiovascular disease. Hcy can induce the increase of cellular reactive oxygen species （ROS） to cause endothelial damage leading to the development of atherosclerosis （AS）. ROS in endothelial cells are mainly derived from Nox4 （NADPH oxidases 4）. NLRP3 is highly expressed in coronary atherosclerosis and aortic sclerosis. NLRP3 is a key mediator of IL-1 family cytokine production in AS， especially when a large amount of ROS produced in cells can cause a large amount of caspase-1 precursor to be cleaved into a biologically active caspase-1 P10 fragment，promote the maturation and secretion of downstream inflammatory factors such as IL-1β and IL-18， impair endothelial cell function， cause cell inflammatory damage and apoptosis， and positive feedback aggravates vascular injury. This study focuses on the role of Nox4 in Hcy-mediated endothelial cell inflammation and apoptosis， and Hcy-induced AS provides a possible mechanism.

Key words：Homocysteine;Atherosclerosis;Nox4;NLRP3

隨著社會(huì)進(jìn)步以及人口老齡化，急性心血管事件的發(fā)生率在逐年增加，成為威脅人類健康的頭號(hào)殺手。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是體內(nèi)蛋氨酸代謝循環(huán)途徑中形成的一種含硫氨基酸，是蛋氨酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，機(jī)體不能自身合成，主要來(lái)源于蛋氨酸中間代謝，當(dāng)機(jī)體內(nèi)維生素B12和葉酸的代謝功能紊亂和胱硫醚-β-合成酶的功能不全或功能缺陷，導(dǎo)致Hcy血癥及動(dòng)脈粥樣硬化 （atherosclerosis，AS），臨床上主要靠口服葉酸及維生素B12降低體內(nèi)Hcy水平。各種臨床實(shí)驗(yàn)及流行病學(xué)研究表明，Hcy是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子[1]。本文主要探討Nox4在Hcy介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥及凋亡的作用，Hcy導(dǎo)致的AS提供可能的機(jī)制。

1同型半胱氨酸與動(dòng)脈粥樣硬化

AS是缺血性心腦血管病的病理學(xué)基礎(chǔ)，多因素引起的血管慢性炎癥性疾病。Hcy是動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。中度，甚至輕度的高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，HHcy）就能使AS的危險(xiǎn)性增加。血漿Hcy水平升高原因有很多，包括：原位基因突變：CBS基因缺陷的純合體可以導(dǎo)致血漿中Hcy的水平升高，5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因缺陷是葉酸代謝中最常見(jiàn)的遺傳性疾病，突變后此酶的活性及功能明顯下降，最終導(dǎo)致血漿Hcy濃度的升高。另外有營(yíng)養(yǎng)和飲食、年齡、性別因素等[2]。近些年來(lái)大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、流行病學(xué)調(diào)查及臨床試驗(yàn)表明，血漿Hcy水平升高是心腦血管疾病及各種原因死亡風(fēng)險(xiǎn)增加的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3]。

目前的研究已經(jīng)證實(shí)Hcy導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化基本機(jī)制包括：Hcy可以對(duì)LDL進(jìn)行氧化修飾后促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖和引起血管內(nèi)皮損傷;促進(jìn)氧化自由基的形成，抑制NO的形成及釋放，使內(nèi)皮依賴的血管舒張反應(yīng)明顯減弱;縮短血小板的存活期，提高其黏附性與聚集性，使血栓的發(fā)生率大大提高，容易造成冠狀動(dòng)脈堵塞;Hcy使血栓素B合成增加，其縮血管和促進(jìn)血小板聚集的作用均可加速動(dòng)脈粥樣硬化和血栓疾病的發(fā)生[4]。

Hcy自身結(jié)構(gòu)具有特殊性，結(jié)構(gòu)中含有高活性巰基，自氧化致使產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，致使細(xì)胞內(nèi)可產(chǎn)生大量的ROS，及其下游一系列應(yīng)激反應(yīng)（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激、甲基化等），破壞內(nèi)皮細(xì)胞間完整性及銜接性，致使巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子，血栓素形成，最終可導(dǎo)致動(dòng)脈斑塊形成[5]。

2 NLRP3炎癥小體在Hcy導(dǎo)致的動(dòng)脈粥樣硬化中的作用

目前對(duì)AS的保守治療主要集中在降低血漿膽固醇水平，但這種治療只是為了降低所有患者未來(lái)心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)[6]。然而，動(dòng)脈粥樣硬化在變態(tài)反應(yīng)性疾病中被越來(lái)越多地認(rèn)為是一種慢性疾病，這為血管的新治療方法鋪平了道路[7]。最新的研究發(fā)證明用單克隆的IL-1β抗體治療可以降低心臟病發(fā)作患者復(fù)發(fā)心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)。鑒于這一試驗(yàn)的積極結(jié)果，通過(guò)對(duì)炎癥假說(shuō)的起源和影響的回顧，探討NLRP3（NOD [nucleotide oligomerization domain]- LRR [leucinerich repeat]- PYD[pyrin domain]-containing protein 3）和白細(xì)胞介素-1家族細(xì)胞因子在AS形成中的影響[8]。NLRP3在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化及主動(dòng)脈硬化中高表達(dá)，并且直接與疾病嚴(yán)重程度及多種臨床危險(xiǎn)因素有關(guān)，包括吸煙、高血壓、糖尿病、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白、膽固醇[9]。

炎癥免疫反應(yīng)是心血管疾病的重要發(fā)病機(jī)制，炎癥小體在炎癥免疫中處于核心地位，在機(jī)體許多炎癥性反應(yīng)中都有著很重要的作用。所有NLR家族，主要通過(guò)釋放受體敏感配體結(jié)合蛋白（ACP）從其抑制物（ACK）中釋放ROS-敏感配體相互作用蛋白（ACP），使其產(chǎn)生的DAMPs（Danger associated molecular patterns）、IL家族、PAMPs（Pathogen-associated molecular patterns），介導(dǎo)細(xì)胞炎癥及凋亡[10]。ROS抑制劑能夠明顯降低Hcy誘導(dǎo)的足細(xì)胞NLRP3炎癥小體成分NLRP3、caspase-1、ASC（Apoptosis-associated speck-like protein containing CARD）的表達(dá)及NLRP3與caspase-1、NLRP3與ASC的共定位形成，且能夠顯著抑制Hcy介導(dǎo)的足細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β的表達(dá)和分泌，說(shuō)明Hcy可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，激活炎癥小體及炎癥反應(yīng)受體，其中NLRP3在該反應(yīng)中起到非常重要的角色[11，12]。

用氧化酶抑制劑處理巨噬細(xì)胞，Hcy誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS水平的增加，NAC預(yù)處理后，ROS減少Hcy誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體成分的表達(dá)與共定位減少，細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-1β、IL-18減少，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)機(jī)制，減輕炎癥損傷，抑制細(xì)胞凋亡及焦亡[13]。因此在近幾年Hcy的致病機(jī)制，探討NLRP3與Hcy的相關(guān)機(jī)制及信號(hào)通路逐漸成為目前研究的熱點(diǎn)。

3 Nox4在Hcy導(dǎo)致的AS中的作用

NADPH氧化酶（NADPH oxidases，Nox）是一特殊的產(chǎn)生ROS的酶類家族，它們通過(guò)催化電子從NADPH轉(zhuǎn)移到分子氧而產(chǎn)生O2-和H2O2[14]。目前已鑒定出7種亞型（Nox1-5，Duox1-2），其中Nox2為經(jīng)典的gp91phox，是中性粒細(xì)胞進(jìn)行吞噬作用所必需的[15]。研究證實(shí)Nox與AS的發(fā)生、AS病灶的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。各種內(nèi)源性危險(xiǎn)因子刺激下，Nox活性增加，ROS產(chǎn)生過(guò)多，導(dǎo)致氧化損傷，ROS通過(guò)各種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，參與血管壁細(xì)胞的各種病理生理過(guò)程，如血管平滑肌細(xì)胞增殖，影響血管內(nèi)皮的舒縮功能，激活的血管內(nèi)皮炎性免疫反應(yīng)及一系列細(xì)胞功能改變等，從而參與AS的發(fā)生和發(fā)展[16]。

Hcy引起的內(nèi)皮損傷中，檢測(cè)Nox1、Nox2、Nox4、Nox5的表達(dá)量，Nox1、Nox5幾乎檢測(cè)不到，而主要檢測(cè)的到是Nox2和Nox4，但是加入Nox2的抑制劑，并不能引起內(nèi)皮損傷的改變，只有加入Nox4的抑制劑才能引起細(xì)胞炎癥因子的改變，說(shuō)明在Hcy引起的內(nèi)皮損傷中，Nox4的表達(dá)扮演著非常重要的作用[17]。Nox2主要表達(dá)在細(xì)胞膜，它的激活受蛋白翻譯后機(jī)制的急性調(diào)控，比如漿細(xì)胞亞單位P44phox的磷酸化和Rac1向細(xì)胞膜的移位。高酯、高糖、血管緊張素、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、機(jī)械刺激等都可激活Nox2。Nox2產(chǎn)生O2-并易于和NO作用使之失活[14]。最近對(duì)動(dòng)物的研究表明，在不同的疾病模型中，ROS的產(chǎn)生通常是保護(hù)性的，盡管這種酶的致病作用也已經(jīng)被證實(shí)?；蜃C據(jù)表明，P22phox是NADPH氧化酶的重要組，實(shí)驗(yàn)研究也證明了其生物活性的存在[18]。此外，在非特異性表達(dá)系統(tǒng)中，Nox4和Nox1的活性都是通過(guò)共同表達(dá)的P22phox被激活的。最早的研究認(rèn)為，敲除p22phox亞基對(duì)NLRP3炎性小體激活起到抑制作用，而3種Nox復(fù)合物（Nox1、Nox2、Nox4）所特有的亞基缺乏的巨噬細(xì)胞對(duì)激活炎癥因子應(yīng)答較差[19]，認(rèn)為NLRP3的激活可能是p22phox依賴性的過(guò)程在或者Nox存在功能冗余。

Nox4調(diào)節(jié)特定的信號(hào)通路和細(xì)胞的功能，依賴于Nox4的表達(dá)水平、細(xì)胞的位置以及細(xì)胞類型。Nox4-/-基因敲除的小鼠，在血壓（全身和肺部）、心臟功能、內(nèi)皮依賴的血管舒縮功能、腦血流量和腎功能方面與野生型小鼠沒(méi)有差異。然而在眾多心血管疾病，如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、肺和心肌纖維化、心衰、應(yīng)激和糖尿病中表達(dá)量增加。因此，在沒(méi)有疾病刺激的條件下，Nox4-/-沒(méi)有表現(xiàn)出異常，如在血壓方面[20]。Nox4是一種誘導(dǎo)型Nox，在面對(duì)各種刺激時(shí)，它的表達(dá)水平是一個(gè)動(dòng)態(tài)反應(yīng)過(guò)程，目前還沒(méi)有完全了解Nox4的病理及生理作用。

4 Nox4是否通過(guò)NLRP3信號(hào)通路參與Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

NADPH復(fù)合物最初被發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)在細(xì)胞呼吸爆發(fā)期間產(chǎn)生ROS，但現(xiàn)在已經(jīng)清楚地發(fā)現(xiàn)，在其他類型的細(xì)胞中，Nox衍生的ROS也參與了細(xì)胞信號(hào)傳遞。Nox1～4均有一個(gè)重要的功能亞基P22phox，其為重要的功能亞基，若加入P22phox抑制劑，幾乎檢測(cè)不到相應(yīng)蛋白的表達(dá)，及下游限號(hào)同路的激活，特別NLRP3炎癥小體的激活，認(rèn)為此激活過(guò)程是獨(dú)立于Nox4的P22phox依賴的過(guò)程[21]。

內(nèi)皮細(xì)胞的ROS主要來(lái)源于Nox4，任何來(lái)源的ROS均可以激活NLRP3炎癥小體，參與炎癥反應(yīng)[1，20]。最早的研究鑒定激活NLRP3的ROS來(lái)源，加入ROS的抑制劑，可抑制NLRP3炎癥小體的激活，加入特異性的Nox的抑制劑，并不能很好的引起NLRP3蛋白表達(dá)水平的改變。隨著近年來(lái)關(guān)于Nox4研究的深入，對(duì)于Nox4的功能及其參與介導(dǎo)的信號(hào)通路，有了新的進(jìn)展，讓我們開(kāi)始重新探討Nox4在Hcy介導(dǎo)的內(nèi)皮損傷及凋亡中作用，以及Nox4是否通過(guò)NLRP3信號(hào)通路參與Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。有研究另外NLRP3蛋白沉默以后，Nox4蛋白表達(dá)水平也受到抑制，猜測(cè)NLRP3和Nox4之間可能存在著一種特殊交互作用，且caspase-1的抑制劑對(duì)Nox4蛋白表達(dá)影響不明顯[22]。在炎癥激活過(guò)程中，特別是Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激及調(diào)亡過(guò)程中，Nox4的表達(dá)增加，參與了NLRP3炎癥小體復(fù)合物激活。Nox4在Hcy介導(dǎo)的內(nèi)皮損傷及凋亡中，扮演著非常重要的作用[9]。

5總結(jié)

Hcy是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其可以增強(qiáng)血管炎癥反應(yīng)，加速動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。血漿Hcy水平升高引起心血管疾病的發(fā)病機(jī)制尚不完善清楚，依然是目前研究的熱點(diǎn)。巨噬細(xì)胞中Hcy能夠激活 NLRP3炎癥小體，同時(shí)誘導(dǎo)IL-1β、IL-18的合成及胞外分泌，促進(jìn)ASC、NLRP3和caspase-1的表達(dá)增多。在Hcy介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型中，Nox4可能起決定性作用，阻斷Nox4可能是抑制Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的關(guān)鍵靶點(diǎn)，為HHcy血癥導(dǎo)致的血管內(nèi)皮損傷提供新的理論基礎(chǔ)。

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收稿日期：2019-4-3;修回日期：2019-4-18

編輯/楊倩