胡立珍 周廣信 霍麗麗

摘要：目的? 探討全自動(dòng)半巢式實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（GeneXpert MTB/RIF）檢測(cè)肺胞灌洗液（BALF）診斷肺結(jié)核的價(jià)值。方法? 采集2016年6月～2018年6月濱州市結(jié)核病防治院已經(jīng)確診的住院菌陰肺結(jié)核269例設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，另收集其他肺部疾病患者87例設(shè)為對(duì)照組。利用支氣管鏡術(shù)收集肺胞灌洗液;肺胞灌洗液采用涂片法、培養(yǎng)法和GeneXpert MTB/RIF法3種方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌，分別對(duì)其陽性率及檢測(cè)菌量進(jìn)行比較。結(jié)果? BALF經(jīng)涂片、培養(yǎng)和GeneXpert MTB/RIF3種方法檢測(cè)，敏感度分別為23.05%、33.83%和62.08%，特異度分別為97.70%、97.70%和100.00%。GeneXpert MTB/RIF法分別與涂片法和培養(yǎng)法結(jié)果比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;涂片法與培養(yǎng)法結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;對(duì)照組涂片和培養(yǎng)均出現(xiàn)2例陽性者，而GeneXpert MTB/RIF為陰性;涂片和培養(yǎng)相同的2例陽性者，經(jīng)基因芯片檢測(cè)確定為NTM。269例菌陰肺結(jié)核BALF涂片陰性者207例，207例涂片陰性者經(jīng)GeneXpert MTB/RIF法檢測(cè)呈陽性者105例，其中GenXpert MTB/RIF 法“極低”量級(jí)50例，占47.62%。269例菌陰肺結(jié)核BALF培養(yǎng)陰性者178例，178例涂片陰性者經(jīng)GeneXpert MTB/RIF法檢測(cè)呈陽性者76例，其中GenXpert MTB/RIF 法“極低”量級(jí)37例，占48.68%。結(jié)論? GeneXpert MTB/RIF技術(shù)結(jié)核分枝桿菌陽性檢出率高于涂片和培養(yǎng)法，對(duì)早期診斷肺結(jié)核具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值，且操作簡(jiǎn)單、快速，值得推廣。

關(guān)鍵詞：菌陰肺結(jié)核;結(jié)核分枝桿菌;GeneXpert MTB/RIF 技術(shù)

中圖分類號(hào)：R521? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.15.056

文章編號(hào)：1006-1959（2019）15-0165-03

Abstract：Objective? To investigate the value of automatic semi-nested real-time PCR （GeneXpert MTB/RIF） in the detection of pulmonary lavage fluid （BALF） for the diagnosis of tuberculosis.Methods? From June 2016 to June 2018， 269 cases of hospitalized sputum tuberculosis diagnosed by Binzhou City Tuberculosis Hospital were set as experimental group， and 87 cases of other lung diseases were collected as control group. The lung cell lavage fluid was collected by bronchoscopy. The lung cell lavage fluid was tested by smear method， culture method and GeneXpert MTB/RIF method to detect Mycobacterium tuberculosis. The positive rate and the amount of bacteria were compared.Results? BALF was tested by smear， culture and GeneXpert MTB/RIF in three methods. The sensitivity was 23.05%， 33.83% and 62.08%， respectively， and the specificities were 97.70%， 97.70% and 100%， respectively. The results of GeneXpert MTB/RIF method were statistically significant compared with the results of smear method and culture method （P<0.05）. The difference between smear method and culture method was statistically significant （P<0.05）. Two positive cases were found in the smear and culture， while the GeneXpert MTB/RIF was negative; the two smears and the same positive ones were identified as NTM by gene chip detection.207 of the 269 cases of BALF smear negative for bacterial negative pulmonary tuberculosis were detected by GeneXpert MTB/RIF method， and 105 of the 207 cases were positive， among which 50 cases （47.62%） were "extremely low" in GenXpert MTB/RIF method.178 of the 269 cases were negative in BALF culture， and 76 of the 178 cases were positive by GeneXpert MTB/RIF method， among which 37 cases （48.68%） were "extremely low" in GenXpert MTB/RIF method.Conclusion? The positive detection rate of Mycobacterium tuberculosis by GeneXpert MTB/RIF technique is higher than that of smear and culture method. It has certain clinical application value for early diagnosis of tuberculosis， and its operation is simple and rapid， which is worthy of promotion.

Key words：Sputum tuberculosis;Mycobacterium tuberculosis;GeneXpert MTB/RIF technology

目前，涂陰肺結(jié)核的診斷仍主要依靠影像學(xué)檢查，影像學(xué)對(duì)肺部異常陰影的發(fā)現(xiàn)率高，但特異性較差，難以定性。臨床上診斷菌陰肺結(jié)核已成為當(dāng)前結(jié)核病控制的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。臨床上超過50%的肺結(jié)核患者為菌陰肺結(jié)核病例[1]。菌陰肺結(jié)核如不給予治療，約50%發(fā)展為涂片陽性，成為新的傳染源。嚴(yán)格地說，痰及病變組織中查出結(jié)核桿菌是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，胸部影像學(xué)檢查不能確診肺結(jié)核。痰的細(xì)菌學(xué)檢查被認(rèn)為是診斷肺結(jié)核的唯一方法。但是細(xì)菌的檢出結(jié)果受諸多因素的影響，使得檢出率較低，如果單純以痰結(jié)核菌檢查作為唯一的診斷標(biāo)準(zhǔn)，勢(shì)必造成大部分結(jié)核患者漏診。本文采用全自動(dòng)半巢式實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（GeneXpert MTB/RIF）對(duì)菌陰肺結(jié)核的支氣管肺胞灌洗液（BALF）進(jìn)行檢測(cè)，為提高菌陰肺結(jié)核臨床的診療水平提供參考。

1材料與方法

1.1一般資料? 采集2016年6月～2018年6月濱州市結(jié)核病防治院已經(jīng)確診的住院菌陰肺結(jié)核患者269例設(shè)為實(shí)驗(yàn)組;其中男性181例，女性88例;年齡22～65歲，平均年齡41.6歲。另收集其他肺部疾病患者87例設(shè)為對(duì)照組，其中男性53例，女性34例;年齡31～72歲，平均年齡50.3歲;肺癌34例、支氣管炎21例、細(xì)菌性肺炎19例、肺氣腫9例、塵肺4例。研究納入患者均能順利采集到支氣管肺胞灌洗液。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，并均知情同意且簽署知情同意書。

1.2菌陰肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)? 菌陰肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)參照有關(guān)資料[2]，為3次痰涂片及1次培養(yǎng)陰性的肺結(jié)核：①典型肺結(jié)核臨床癥狀和胸部X線表現(xiàn);②抗結(jié)核治療有效;③臨床可排除其它非結(jié)核性肺部疾患;④PPD（5U）強(qiáng)陽性，血清抗結(jié)核抗體陽性;⑤痰結(jié)核菌PCR和探針檢測(cè)呈陽性;⑥肺外組織病理證實(shí)結(jié)核病變;⑦BALF檢出抗酸分支桿菌;⑧支氣管或肺部組織病理證實(shí)結(jié)核病變。具備①～⑥中3項(xiàng)或⑦～⑧條中任何1項(xiàng)可確診。

1.3標(biāo)本采集? 由臨床醫(yī)師行纖維支氣管鏡術(shù)，留取BALF盛于專用容器中，每例各留取1份，每份至少10 ml送檢;由實(shí)驗(yàn)室人員將每份標(biāo)本倒入離心管，3000 r/min離心集菌30 min，棄去上清液留取沉淀物約2 ml備用。

1.4主要檢測(cè)儀器與試劑? GeneXpert MTB/RIF系統(tǒng)由美國(guó)Cepheid公司生產(chǎn)，試劑盒原裝進(jìn)口，由天津儀美科技有限公司提供。

1.5檢測(cè)方法? 分別從兩組沉淀物中，各吸取0.05 ml至載玻片上涂抹成10 mm×20 mm卵圓形大小，自然干燥后，進(jìn)行萋尼氏染色鏡檢抗酸桿菌（AFB）;每例再吸取沉淀物1 ml于另一專用容器中，加入等量4%氫氧化鈉處理15 min，分別吸取0.1 ml接種酸性羅氏培養(yǎng)基上，37℃孵育，4周報(bào)告結(jié)果;涂片和分離培養(yǎng)按《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[3]要求;將剩余標(biāo)本約1 ml，加入Xpert MTB/RIF處理液2 ml，蓋緊劇烈搖動(dòng)10～20次，室溫處理15 min后，用無菌吸管吸取2 ml，加入Xpert MTB/RIF Cartridge中的標(biāo)本孔中，注意防止產(chǎn)生氣泡，蓋緊蓋子后上機(jī)開始測(cè)試。

1.6染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)? 抗酸染色鏡檢AFB，據(jù)涂片AFB菌量多少判為4+、3+、2+、1+、陰性，AFB≥10條/每個(gè)視野為4+，AFB 1～9條/每個(gè)視野為3+，AFB 1～9條/10個(gè)視野為2+，AFB 3～9條/100個(gè)視野為1+，連續(xù)觀察300個(gè)視野未發(fā)現(xiàn)AFB為陰性;結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)法，據(jù)培養(yǎng)基上菌落覆蓋斜面多少判為4+、3+、2+、1+、陰性，菌落鋪滿培養(yǎng)基斜面為4+，菌落占培養(yǎng)基斜面的3/4為3+，菌落占培養(yǎng)基斜面的1/2為2+，菌落占培養(yǎng)基斜面的1/4為1+，培養(yǎng)基斜面無菌落生長(zhǎng)為陰性。GeneXpert MTB/RIF結(jié)果判斷依照探針的循環(huán)閾值（ct值）[4]，當(dāng)內(nèi)對(duì)照探針ct值≤38即為陽性，5個(gè)探針中至少2個(gè)探針ct值≤38即為檢測(cè)到MTB，可進(jìn)一步按ct值對(duì)MTB進(jìn)行半定量，ct值<16為高含量，ct值16～22為中含量，ct值22～28為低含量，ct值>28為極低含量 。敏感度為實(shí)驗(yàn)組陽性例數(shù)/實(shí)驗(yàn)組總例數(shù)，特異度為對(duì)照組陰性例數(shù)/對(duì)照組總例數(shù)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? 建立Excel數(shù)據(jù)庫(kù)收集數(shù)據(jù)，運(yùn)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析，計(jì)數(shù)資料使用（%）表示，不同方法檢測(cè)結(jié)果比較采用？字2檢驗(yàn)，P<0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1涂片、培養(yǎng)和GeneXpert MTB/RIF法3種方法檢測(cè)結(jié)果比較? 兩組BALF經(jīng)涂片、培養(yǎng)和GeneXpert MTB/RIF 3種方法檢測(cè)，敏感度分別為23.05%、33.83%和62.08%，特異度分別為97.70%、97.70%和100.00%。GeneXpert MTB/RIF法與涂片法結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（？字2=83.823，P=0.000）;GeneXpert MTB/RIF法與培養(yǎng)法比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（？字2=43.016，P=0.000）;涂片法與培養(yǎng)法比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（？字2=7.681，P=0.006）;對(duì)照組涂片和培養(yǎng)均出現(xiàn)2例陽性者，而GeneXpert MTB/RIF為陰性;涂片和培養(yǎng)相同的2例陽性者，經(jīng)基因芯片檢測(cè)確定為NTM，見表1。

2.2涂片、培養(yǎng)和GeneXpert MTB/RIF法3種方法檢測(cè)菌量比較? 269例菌陰肺結(jié)核BALF涂片陰性者207例，207例涂片陰性者經(jīng)GeneXpert MTB/RIF法檢測(cè)呈陽性者105例，其中GenXpert MTB/RIF 法“極低”量級(jí)50例，占47.62%（50/105）。269例菌陰肺結(jié)核BALF培養(yǎng)陰性者178例，178例涂片陰性者經(jīng)GeneXpert MTB/RIF法檢測(cè)呈陽性者76例，其中GenXpert MTB/RIF 法“極低”量級(jí)37例，占48.68%（37/76）。269例菌陰肺結(jié)核BALF，3種方法檢測(cè)菌量情況見表2。

3討論

結(jié)核病的病原菌是結(jié)核分枝桿菌，結(jié)核分枝桿菌感染是患結(jié)核病首要和必須的基本條件，由于涂片法和培養(yǎng)法敏感度較低，致使陽性檢出率較低而出現(xiàn)“菌陰”肺結(jié)核。菌陰肺結(jié)核是指以痰涂片和培養(yǎng)法（3次涂片1次培養(yǎng)）檢查分枝桿菌均為陰性的活動(dòng)性肺結(jié)核。涂片和培養(yǎng)結(jié)核分枝菌的陽性或陰性檢出受多種因素的影響：①標(biāo)本的質(zhì)量和性質(zhì);②病變?cè)诜我暗奈恢?③病變是封閉或開放;④病變的性質(zhì)和其中能夠排出的菌量及排出時(shí)間間歇;⑤結(jié)核分枝桿菌存在的形態(tài);⑥培養(yǎng)標(biāo)本含有的菌量和是否為活菌;⑦培養(yǎng)前處理的過程中，結(jié)核分枝桿菌損傷程度;⑧培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的有限性等[3]。由于菌陰肺結(jié)核較難獲得細(xì)菌學(xué)依據(jù)，臨床診斷在綜合分析患者的癥狀、體癥、影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果的同時(shí)，及時(shí)獲得來自患者病變處標(biāo)本的GeneXpert MTB/RIF法檢測(cè)結(jié)果是十分必要的。

GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)以半巢式實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)、以rpoB基因?yàn)榘谢?，自?dòng)提取DNA后擴(kuò)增rpoB基因的192 bp片段進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用6中分子信標(biāo)同時(shí)檢測(cè)6種探針，其中5個(gè)互相重疊的分子探針（分別以探針A～E命名）選擇性覆蓋rpoB基因的81 bp核心區(qū)，用于檢測(cè)利福平耐藥，另有一個(gè)球芽孢桿菌（Bacillus globigii）特異探針作為內(nèi)對(duì)照，以判斷DNA擴(kuò)增效率及檢測(cè)效率。GeneXpert MTB/RIF技術(shù)整合了PCR檢測(cè)所需要的樣品準(zhǔn)備、DNA擴(kuò)增、檢測(cè)3個(gè)步驟，標(biāo)本準(zhǔn)備完全實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，檢測(cè)全過程不足2 h完成。

本研究結(jié)果顯示，3種方法檢測(cè)BALF中，GeneXpert MTB/RIF法特異度為100.00%，陽性檢出率高于涂片法及培養(yǎng)法，對(duì)照組涂片和培養(yǎng)均出現(xiàn)2例陽性者，而GeneXpert MTB/RIF為陰性;涂片和培養(yǎng)相同的2例陽性者，經(jīng)基因芯片檢測(cè)確定為NTM。與國(guó)內(nèi)報(bào)道菌陰肺結(jié)核BALF涂片陽性率在12%～30%，BALF培養(yǎng)陽性率在25.4%～73.1%，GeneXpert MTB/RIF法陽性率在32.8%～80%[5-7]，結(jié)果相差較大，可能與患者的個(gè)體化及取材有關(guān)，研究對(duì)象和標(biāo)本量的不同、標(biāo)本留取的數(shù)量和處理方法的不同、實(shí)驗(yàn)方法的不同等均會(huì)影響陽性檢出率。但報(bào)道中GeneXpert MTB/RIF法陽性率均顯著高于涂片法和培養(yǎng)法。本研究涂片陰性者中，GenXpert MTB/RIF 法陽性檢出了105例，其中其中GenXpert MTB/RIF 法“極低”量級(jí)50例，占47.62%（50/105）;培養(yǎng)陰性者中，GenXpert MTB/RIF 法陽性檢出了76例，其中GenXpert MTB/RIF 法“極低”量級(jí)37例，占48.68%（37/76）。提示GenXpert MTB/RIF 試驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)結(jié)核桿菌含量較低的標(biāo)本。

GeneXpert MTB/RIF技術(shù)操作簡(jiǎn)便，快速，陽性檢出率較高，該技術(shù)的應(yīng)用對(duì)菌陰肺結(jié)核診斷具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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收稿日期：2019-3-20;修回日期：2019-3-29

編輯/肖婷婷