張佳佳 張艷萍 劉玉輝 梁麗華

近十年來，我國(guó)肺癌的發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢(shì)，且女性的發(fā)病率上升更快。肺癌的分期極大得影響了患者的治療和預(yù)后，原位癌期間患者的治愈率接近100%，隨著病情的進(jìn)展，患者的五年生存率迅速下降，Ⅰ期患者為60%～90%，Ⅲ期及以上的患者則驟降至5%～20%[1]。在國(guó)內(nèi)的肺癌早期篩查中，常把40歲以上男性，有腫瘤家族史或肺部慢性疾病，吸煙史大于20年、曾吸煙但戒煙不到10年、長(zhǎng)期接受二手煙或有粉塵、化學(xué)藥品職業(yè)暴露史者作為高危人群[2]。

伴隨著支氣管活檢、經(jīng)皮肺穿刺等技術(shù)的發(fā)展，考慮到肺癌的組織學(xué)分型對(duì)化療方案和手術(shù)方式選擇的影響，對(duì)高度疑似肺癌的患者可以進(jìn)行早期的病理檢查，以減少漏診。但肺癌的異質(zhì)性較大，大約25%的支氣管活檢標(biāo)本單靠組織學(xué)形態(tài)不能明確分類[3]，需結(jié)合免疫組織化學(xué)標(biāo)志幫助確診。

本研究檢測(cè)不同年齡、病理類型、TNM分期、伴或不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的80例肺癌患者和60例肺部良性結(jié)節(jié)患者NapsinA、NSE、Ki67的表達(dá)，旨在探討NapsinA、NSE、Ki67的單獨(dú)檢測(cè)、聯(lián)合檢測(cè)結(jié)合臨床病理分析在肺癌早期診斷中的意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

選取2017年1月至2018年12月于中一東北國(guó)際醫(yī)院行支氣管鏡活檢的肺癌患者80例，肺部良性結(jié)節(jié)患者60例作為研究對(duì)象，其中男性64例，女患性55例；50周歲以上者55例，中位年齡57.75歲；患者均無心、肝、腎等重要臟器器質(zhì)性病變，無其他部位的惡性腫瘤，支氣管鏡活檢前均未接受任何治療。80例肺癌患者中包括25例腺癌，18例鱗癌，37例小細(xì)胞癌；其中31例發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；按2018年V3版NCCN非小細(xì)胞肺癌指南TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[4],TNM分期Ⅰ～Ⅱ期38例，Ⅲ～Ⅳ期42例。所有患者及家屬均對(duì)本研究知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

對(duì)研究納入的140例患者均由支氣管活檢取得病理組織，對(duì)獲得的組織切片行免疫組化染色，染色采用En Vision兩步法[5]，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；用已知肺癌陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照,以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，檢測(cè)80例肺癌患者和60例肺部良性結(jié)節(jié)患者NapsinA、NSE、Ki67的表達(dá)差異。S-P試劑盒購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司，鼠抗人NSE、 Ki67、多克隆抗體和兔抗人NapsinA多克隆抗體均購(gòu)于北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 結(jié)果判定

NapsinA分布于細(xì)胞質(zhì)，以胞質(zhì)被染成棕黃色者為陽(yáng)性細(xì)胞，P53及Ki67蛋白主要在細(xì)胞核內(nèi),細(xì)胞核為棕黃色者判定為陽(yáng)性。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比及著色強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)[6]：無明顯著色或陽(yáng)性細(xì)胞或陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10% 為陰性(-),陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 10%～25% 為弱陽(yáng)性(+),陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 25%～50% 為中度陽(yáng)性(++),陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法和指標(biāo)

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算各指標(biāo)陽(yáng)性率，組間采用χ2檢驗(yàn)， 取檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。計(jì)算各指標(biāo)的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值。

2 結(jié)果

2.1 Napsin A、NSE、Ki67在兩組中的表達(dá)情況

所納入的80例不同類型的肺癌患者中，Napsin A的陽(yáng)性率為31.25%，肺部良性結(jié)節(jié)患者其陽(yáng)性率為8.33%。NSE在肺癌患者和良性結(jié)節(jié)患者中的陽(yáng)性率分別為93.75%和6.67%，72例肺癌患者呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。Ki67在肺癌患者中的陽(yáng)性率達(dá)80.00%，59例患者表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，4例患者呈中度陽(yáng)性，3例患者呈弱陽(yáng)性，良性結(jié)節(jié)患者的陽(yáng)性率為15.00%。Napsin A、NSE和Ki67的表達(dá)在肺癌組織和良性結(jié)節(jié)間存在顯著差異(P<0.05)(表1)。

表1 NapsinA、NSE、Ki67在肺部結(jié)節(jié)中的表達(dá)情況/例

2.2 三個(gè)指標(biāo)與肺癌臨床病理特征的關(guān)系

三個(gè)指標(biāo)的陽(yáng)性率在50歲以下和50歲以上的患者間均不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，僅有Ki67的陽(yáng)性率在組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者陽(yáng)性率為73.47%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者則高達(dá)96.77%，組間差異顯著(χ2=7.143，P=0.006)。

Napsin A在腺癌中的陽(yáng)性率為100%，在鱗癌和小細(xì)胞肺癌中均不表達(dá)。NSE在非小細(xì)胞肺癌(腺癌和鱗癌)中的陽(yáng)性率顯著高于小細(xì)胞肺癌(χ2=6.198,P=0.018)。而Ki67在腺癌、鱗癌、小細(xì)胞癌三組中兩兩組間均不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

Ⅰ～Ⅱ期患者中Napsin A 陽(yáng)性率(34.21%)略高于Ⅲ～Ⅳ期患者(28.57%)，Ⅰ～Ⅱ期患者中NSE陽(yáng)性率(92.11%)略低于Ⅲ～Ⅳ期患者(95.24%)，而Ⅰ～Ⅱ期Ki67陽(yáng)性率為68.42%，Ⅲ～Ⅳ期其陽(yáng)性率為95.23%，Ⅲ～Ⅳ期顯著高于Ⅰ～Ⅱ期(χ2=9.937，P=0.002)。在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中及Ⅲ～Ⅳ期和Ⅰ～Ⅱ期的患者中，Ki67陽(yáng)性率均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示Ki67很可能與肺癌的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展有關(guān)，與肺癌的組織學(xué)類型無關(guān)(表2)。

表2 NapsinA、NSE、Ki67表達(dá)與肺癌患者各病理指標(biāo)的相關(guān)性/例

2.3 NSE、Ki67兩個(gè)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的診斷價(jià)值

80例肺癌患者中，有65例NSE、Ki67檢測(cè)均呈陽(yáng)性，僅有4例都為陰性，在60例良性結(jié)節(jié)中，僅有2例均呈陽(yáng)性，為肺結(jié)核。

兩個(gè)指標(biāo)中NSE的敏感度(93.75%)、特異度(94.87%)、準(zhǔn)確度(94.12%)、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(97.40%)及陰性預(yù)測(cè)值(88.09% )均高于Ki67，提示NSE對(duì)肺部結(jié)節(jié)良惡性鑒別方面的診斷價(jià)值高于Ki67。若對(duì)兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，五個(gè)指標(biāo)均能得到提高，聯(lián)合檢測(cè)的敏感性為94.20%，特異性為96.88%、準(zhǔn)確度為95.05%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為98.48%，陰性預(yù)測(cè)值為88.57%，但是與單獨(dú)指標(biāo)的檢測(cè)相比沒有顯著提高(表3)。

表3 NSE、Ki67聯(lián)合檢測(cè)診斷價(jià)值對(duì)比/%

3 討論

NapisnA是1種在肺和腎高表達(dá)的胃酶樣天冬氨酸蛋白酶，在肺腺癌及肺Ⅱ型上皮中的表達(dá)敏感度顯著強(qiáng)于表面活性蛋白A和B[7]。本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺腺癌中NapisnA陽(yáng)性率高于NSE、Ki67，具有較高的敏感性和特異性，陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)、分布廣，即使低分化亦表現(xiàn)為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。故而Napsin A可以作為肺腺癌特異性診斷的檢測(cè)指標(biāo)，相對(duì)于肺部結(jié)節(jié)的良惡性鑒別，更適合作為確認(rèn)為肺癌的患者的進(jìn)一步組織學(xué)分型。支氣管活檢標(biāo)本體積小且肺癌的異質(zhì)性較大，僅僅通過形態(tài)學(xué)無法準(zhǔn)確的進(jìn)行分型，而肺癌組織學(xué)類型的明確對(duì)化療方案選擇非常重要，所以用Napsin A對(duì)肺癌進(jìn)行組織學(xué)分型對(duì)患者的早期治療具有極大的價(jià)值。

NSE在神經(jīng)組織和神經(jīng)內(nèi)分泌組織中以二聚體的活性形式存在，是特異性存在于正常的神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞中的一種糖酵解酶，肺癌組織中的NSE水平可高出正常肺組織數(shù)倍[8],是小細(xì)胞肺癌的重要標(biāo)記物。NSE在肺癌患者中有極高的陽(yáng)性率、敏感性、特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，本研究中 NSE在非小細(xì)胞肺癌(腺癌和鱗癌)中的陽(yáng)性率顯著高于小細(xì)胞肺癌，說明在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中,非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌間存在著不同的與NSE相關(guān)的分子機(jī)制。結(jié)合相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道[9]，可以認(rèn)為NSE在非小細(xì)胞肺癌的診斷上優(yōu)于其他腫瘤標(biāo)記物指標(biāo)。

Ki67基因與細(xì)胞的增殖相關(guān),其表達(dá)在整個(gè)細(xì)胞周期中受到精確、嚴(yán)格的控制，在G2期和M期達(dá)到表達(dá)峰值，常見于甲狀腺皮質(zhì)細(xì)胞、未分化的精細(xì)胞及胃腸腺體的頸黏液細(xì)胞[10]。其編碼的Ki67蛋白參與有絲分裂磷酸化過程，是腫瘤細(xì)胞增殖所必需的DNA結(jié)合蛋白[11]，故而被視作辨認(rèn)細(xì)胞群中增生細(xì)胞的良好標(biāo)志。國(guó)內(nèi)有文獻(xiàn)報(bào)道Ki67的表達(dá)與癌細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)攻擊密切相關(guān)，Ki67 蛋白的表達(dá)能促進(jìn)腫瘤血管新生，降低細(xì)胞間的粘附力，并重塑細(xì)胞外基質(zhì)[12]，亦有學(xué)者認(rèn)為Ki67的表達(dá)與肺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。雖然在本研究中，Ki67的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值均低于NSE，但是Ki67在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者間及Ⅲ～Ⅳ期和Ⅰ～Ⅱ期的患者間，陽(yáng)性率均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示Ki67很可能在預(yù)測(cè)肺癌的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展方面有較大的臨床價(jià)值。

區(qū)別于其他的廣譜腫瘤標(biāo)志物和肺癌標(biāo)志物，本研究所探討的3個(gè)指標(biāo)在肺癌的早期診斷方面均有自己的獨(dú)到之處。NSE在肺癌組織中具有高度的敏感性和特異性，在結(jié)節(jié)的良惡性鑒別上價(jià)值大；Ki67在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或TNM分期Ⅲ～Ⅳ期的患者中表達(dá)顯著提升，為預(yù)測(cè)肺癌的惡性生物學(xué)行為提供了參考，NSE和Ki67的聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性預(yù)測(cè)值高達(dá)98.48%，極具臨床價(jià)值；而Napsin A可以作為肺腺癌特異性診斷的檢測(cè)指標(biāo)，輔助單純的病理形態(tài)學(xué)分型進(jìn)行進(jìn)一步的肺癌組織學(xué)分型，為針對(duì)性的化療提供指導(dǎo)。故而對(duì)于肺部有結(jié)節(jié)的患者或肺癌的高危人群，可以考慮在臨床病史、影像學(xué)資料等的基礎(chǔ)上，對(duì)這3個(gè)指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合、貫序的檢測(cè)，有助于肺癌的早期診斷，并對(duì)肺癌的組織學(xué)類型、發(fā)展、預(yù)后等進(jìn)行全方位的評(píng)估。

綜上所述，對(duì)于肺癌患者，Napsin A是肺腺癌特異性的檢測(cè)指標(biāo)，NSE和Ki67是具有高度敏感性和特異性的檢測(cè)指標(biāo)，聯(lián)合檢測(cè)NSE和Ki67有利于提高診斷的準(zhǔn)確性，對(duì)于肺癌和良性結(jié)節(jié)的鑒別有重要的參考價(jià)值。Ki67的過表達(dá)很可能與肺癌的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展有關(guān)。