程 鋼，黃鄧高，梁 穎，王偉鋒，符先先，袁 峰

0 引言

放射性唾液腺損傷是頭頸部癌癥放射治療后常見的不良反應(yīng)[1-2]，鼻咽癌是華南地區(qū)高發(fā)腫瘤，放射治療是鼻咽癌的主要根治性手段，97.9%的鼻咽癌患者放療后會(huì)發(fā)生放射性唾液腺損傷，臨床表現(xiàn)為口干、吞咽和發(fā)音困難、味覺喪失、念珠菌感染、齲齒等[3-5]。唾液腺由一些腺泡細(xì)胞組成，對放射線敏感，放射性唾液腺損傷主要是損傷腺泡細(xì)胞[6-7]。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)具有向不同胚層細(xì)胞增殖和分化的能力，有研究報(bào)道其已誘導(dǎo)出神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞等[8-9]，向唾液腺腺泡細(xì)胞的分化也有動(dòng)物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)獲得了成功，為臨床唾液腺腺泡細(xì)胞損傷的修復(fù)開辟了一個(gè)新的治療方法[10]。本研究觀察了Notch信號(hào)通路在骨髓MSCs分化成唾液腺腺泡細(xì)胞過程中的作用，為MSCs分化成腺泡細(xì)胞的調(diào)控提供更多的靶分子。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 40只1周齡健康雄性SD大鼠和40只6～8周齡健康雄性SD大鼠購自海南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，DMEM/F12 培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶購自美國Sigma公司，Notch、α-淀粉酶抗體購自美國Cell Signal公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記二抗購自美國RD公司，免疫組織化學(xué)試劑盒購自武漢博士德生物科技技術(shù)有限公司，分層培養(yǎng)Transwell小室購自美國Corning 公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.2 骨髓MSCs的分離和鑒定 用頸椎脫臼法處死6～8周健康SD大鼠，無菌分離股骨及脛骨，剪斷兩端，注射器吸取DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，加入10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素，37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，24 h后去除懸浮細(xì)胞，保留貼壁細(xì)胞。MSCs的鑒定采用驗(yàn)證其向脂肪細(xì)胞分化的潛能，貼壁細(xì)胞加入誘導(dǎo)劑繼續(xù)培養(yǎng)2周，油紅-O染色觀察脂肪細(xì)胞分化情況。

1.3 唾液腺腺泡細(xì)胞的分離和鑒定 用頸椎脫臼法處死1周齡健康SD大鼠，75%酒精浸泡5 min，摘除雙側(cè)頜下腺，去除腺體周圍被膜、脂肪和結(jié)締組織，將腺體剪成1 mm3左右組織塊，0.125%Ⅱ型膠原酶37 ℃水浴消化40 min，吹打組織制備細(xì)胞懸液，培養(yǎng)于腺細(xì)胞專用培養(yǎng)基，利用差速黏附法純化腺泡細(xì)胞，純化的細(xì)胞爬片后，4%多聚甲醛固定，免疫組織化學(xué)染色，α-淀粉酶染色陽性為腺泡細(xì)胞。

1.4 骨髓MSCs的誘導(dǎo)分化 Transwell小室分上下2層，中間有生物膜相隔，上下層細(xì)胞不會(huì)接觸，但細(xì)胞分泌的因子可相互影響。實(shí)驗(yàn)分為誘導(dǎo)分化組和對照組，誘導(dǎo)分化組：上層MSCs、下層腺泡細(xì)胞，MSCs∶腺泡細(xì)胞=1∶4，對照組：上下層均是MSCs，1×104/孔。培養(yǎng)2周后，收集細(xì)胞上層MSCs細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測淀粉酶抗體染色陽性的MSCs向腺泡細(xì)胞分化情況。

1.5 Notch蛋白的檢測 實(shí)驗(yàn)分為4組，每組各10只。A組：上下層均是MSCs；B組：上層MSCs和下層腺泡細(xì)胞共培養(yǎng)；C組：上層MSCs和下層腺泡細(xì)胞共培養(yǎng)，加入Notch激活劑Jagged1；D組：上層MSCs和下層腺泡細(xì)胞共培養(yǎng)，加入Notch抑制劑DAPT。培養(yǎng)2周后，收獲上層MSCs，Western blot測定Notch蛋白表達(dá)情況，SDS-PAGE凝膠分離蛋白，電轉(zhuǎn)膜后，封閉液孵育膜1 h，加入Notch1抗體過夜孵育，加入二抗孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法檢測Notch蛋白表達(dá)。流式細(xì)胞儀檢測不同分組上層MSCs向腺泡細(xì)胞分化情況。

1.6 腺泡細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測 制備的單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，取200 μl加入淀粉酶抗體一抗和FITC標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h，流式細(xì)胞儀檢測抗體標(biāo)記陽性細(xì)胞所占的比例，簡述如下：前向散射光和側(cè)向散射光做門R1，去除細(xì)胞碎片，關(guān)聯(lián)R1，F(xiàn)L1通道設(shè)置R2，檢測FITC陽性細(xì)胞的比例。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件，兩組獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，組間比較采用LSD檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Transwell小室共培養(yǎng)誘導(dǎo)了MSCs向腺泡細(xì)胞分化 分離的骨髓MSCs貼壁生長，均一的長梭形，誘導(dǎo)2周后油紅-O染色，胞漿內(nèi)可見紅色脂滴。制備的唾液腺腺泡細(xì)胞差速黏附法去除成纖維細(xì)胞，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿6～8 d傳代1次，第3代時(shí)細(xì)胞爬片，α-淀粉酶免疫組化染色，見細(xì)胞α-淀粉酶陽性。Transwell小室混合培養(yǎng)后，流式細(xì)胞儀檢測小室上層MSCs中α-淀粉酶陽性的腺泡細(xì)胞比例，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)分化組α-淀粉酶陽性細(xì)胞的比例為52.34%±8.26%，對照組未檢測到陽性細(xì)胞。見圖1。

圖1 對照組(A)、誘導(dǎo)分化組(B)腺泡細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測

2.2 Notch蛋白在MSCs向腺泡細(xì)胞分化中的作用 從圖2可見，B組Notch蛋白表達(dá)量顯著高于A組。C組Notch蛋白表達(dá)量顯著高于B組。D組Notch蛋白表達(dá)量顯著高于B組。從表1可見，流式細(xì)胞儀檢測A、B、C、D組上層MSCs中α-淀粉酶染色陽性腺泡細(xì)胞的比例分別為0、52.34%±8.26%、66.72%±9.43%、38.55%±6.81%，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 Notch信號(hào)的Western blot檢測

注：A.上下層均為MSCs；B.上層MSCs和下層腺泡細(xì)胞；C.上層MSCs和下層腺泡細(xì)胞，加入Jagged1；D.上層MSCs和下層腺泡細(xì)胞，加入DAPT

表1 不同分組MSCs向腺泡細(xì)胞分化的比較

注：*與A組比較，P<0.01；#與B組比較，P<0.05；△與C組比較，P<0.01

3 討論

放射性唾液腺損傷的機(jī)制目前尚不明確，因此，仍然缺少特效的預(yù)防和治療方法[11-12]，臨床上的治療多是針對癥狀的姑息性治療，例如，使用唾液替代物或唾液分泌刺激膽堿能劑。代用品幾乎不可能復(fù)制天然唾液的所有功能，膽堿能藥物雖然可以刺激未受損腺體的天然唾液分泌，但是長期服用后的出汗、過度流淚和胃腸道疼痛等不良反應(yīng)，給患者的生活帶來新的不利影響[13-15]。

MSCs最大的特點(diǎn)是在合適的條件可分化為各種來源的細(xì)胞，其作為種子細(xì)胞越來越多地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[16-17]。祁荊荊等[18]在頜下腺注射間充質(zhì)干細(xì)胞治療干燥綜合征，發(fā)現(xiàn)了修復(fù)受損腺泡細(xì)胞的作用。筆者前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以發(fā)揮治療小鼠放射性唾液腺損傷作用[19]。本研究在此基礎(chǔ)上也構(gòu)建了誘導(dǎo)MSCs分化成唾液腺腺泡細(xì)胞的3D細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)分化2周后，52.34%±8.26%的MSCs分化為α-淀粉酶陽性細(xì)胞的腺泡細(xì)胞，與梁亮等[20]的轉(zhuǎn)化效率相接近。研究MSCs向腺泡細(xì)胞分化的機(jī)制，對于提高轉(zhuǎn)化效率具有積極的意義[21]。王繼榮等[22]研究顯示，Notch信號(hào)在骨髓MSCs的分化過程中發(fā)揮著重要的作用，Notch信號(hào)通路廣泛存在于動(dòng)物和人體，進(jìn)化上高度保守，參與胚胎、細(xì)胞發(fā)育。維持造血干細(xì)胞的自我更新，調(diào)節(jié)血管生成，其主要的生理功能體現(xiàn)在調(diào)節(jié)細(xì)胞分化與組織發(fā)育上[23-24]。Notch信號(hào)通路對MSCs的分化起重要的調(diào)節(jié)作用，Notch通路可促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞分化，Notch通路的激活是啟動(dòng)軟骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵[25-26]。圖1顯示，B組Notch蛋白表達(dá)量顯著高于A組，說明上層MSCs和下層腺泡細(xì)胞共培養(yǎng)較單獨(dú)的MSCs 培養(yǎng)Notch蛋白表達(dá)量升高，存在Notch通路的激活。C組Notch蛋白表達(dá)量顯著高于B組，說明加入Notch信號(hào)激活劑后，蛋白的表達(dá)顯著升高。D組Notch蛋白表達(dá)量顯著高于B組，說明加入Notch信號(hào)抑制劑后，蛋白的表達(dá)顯著減低。流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果也顯示，Notch通路的激活可能在誘導(dǎo)上層MSCs向腺泡細(xì)胞分化過程中發(fā)揮了作用，隨后加入Notch信號(hào)激活劑或抑制劑后，MSCs向腺泡細(xì)胞分化的比例也會(huì)相應(yīng)增強(qiáng)或減弱。提示Notch通路的激活在誘導(dǎo)MSCs向腺泡細(xì)胞分化的過程中發(fā)揮了重要作用，調(diào)節(jié)Notch通路有可能調(diào)節(jié)MSCs轉(zhuǎn)化為唾液腺腺泡細(xì)胞的效率。

綜上所述，MSCs向唾液腺腺泡細(xì)胞分化過程中Notch通路激活，激活或抑制Notch通路可以增強(qiáng)或減弱MSCs轉(zhuǎn)化為唾液腺腺泡細(xì)胞的效率。但是本研究僅僅是體外實(shí)驗(yàn)階段，體內(nèi)注入MSCs后，能否到達(dá)唾液腺分化為腺泡細(xì)胞，還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。