武小杰，陳菁

(武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院呼吸內(nèi)科，武漢 430022)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種高患病率、高致殘率和高死亡率的慢性疾病，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是COPD的主要發(fā)病機(jī)制，但二者的潛在關(guān)聯(lián)有待進(jìn)一步確認(rèn)[2-3]。目前COPD的治療主要集中在減輕氣道的慢性炎癥如抗氧化治療，其通過清除體內(nèi)活性氧自由基，增加總超氧化物歧化酶的活性，起到保護(hù)細(xì)胞的作用[4-5]，但抗氧化治療是否減輕炎癥反應(yīng)，目前的研究并不十分清楚。國(guó)外有研究報(bào)道N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)能降低羊胚胎上皮細(xì)胞在香煙煙霧提取物刺激后白細(xì)胞介素(IL)-6的表達(dá)[6]。國(guó)內(nèi)針對(duì)NAC在COPD治療方面的研究較多，如對(duì)COPD急性加重、血?dú)夥治鲋笜?biāo)的影響等[7-8]。但筆者未見涉及COPD患者NAC治療前后炎癥指標(biāo)的改變，特別是COPD患者人體細(xì)胞刺激后對(duì)NAC反應(yīng)的研究。2016年3月—2017年4月，筆者觀察了COPD患者在NAC治療前后炎癥因子和肺功能的變化，并收集COPD患者的單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)在體外研究NAC對(duì)其的影響，旨在探討抗氧化治療對(duì)COPD患者體內(nèi)炎癥因子及肺功能的影響，及在細(xì)胞水平進(jìn)一步研究抗氧化治療對(duì)外界因素刺激后的炎癥反應(yīng)的影響。

1 資料與方法

1.1臨床資料 本研究采用臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，選取我院收治的COPD穩(wěn)定期患者90例，通過隨機(jī)數(shù)字表法將患者隨機(jī)分為治療組(46例)和對(duì)照組(44例)。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均符合COPD的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，穩(wěn)定期研究對(duì)象為近3個(gè)月無(wú)COPD急性加重患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有其他呼吸系統(tǒng)疾病，如哮喘、支氣管擴(kuò)張、間質(zhì)性肺病及肺結(jié)核，有肺手術(shù)病史；患有血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病、精神障礙、嚴(yán)重全身疾病者。本研究已通過我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者了解研究過程并簽署知情同意書。

1.2治療方法 對(duì)照組患者給予COPD基礎(chǔ)治療，包括吸入藥物治療，如吸入糖皮質(zhì)激素、β2-受體激動(dòng)藥和(或)膽堿能受體阻斷藥等；治療組患者在對(duì)照組基礎(chǔ)上給予NAC泡騰片(浙江金華康恩貝生物制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)號(hào)H20057334，規(guī)格：每片600 mg)600 mg，po，bid，兩組療程均為半年。

1.3患者指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1血清炎癥因子測(cè)定 采集患者治療前后晨起空腹外周靜脈血5 mL，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血清中IL-6、IL-8水平。IL-6試劑盒(貨號(hào)：JK-SJ-36472)、IL-8試劑盒(貨號(hào)：JK-SJ-36468)，兩種試劑盒均購(gòu)于上海晶抗生物工程有限公司。

1.3.2肺功能評(píng)估 采用德國(guó)耶格Jaeger 肺功能儀，由專業(yè)人員操作，分別測(cè)定第1秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值百分比(FEV1%pred)及第1秒用力呼氣容積(FEV1)/用力肺活量(FVC)即一秒率，每次測(cè)定3 次，取平均值。

1.4外周血的PBMC刺激實(shí)驗(yàn)

1.4.1PBMC分離及培養(yǎng) 取治療組20例COPD患者外周血4 mL與無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS，HyClone?？寺∮邢薰?，貨號(hào)：SH30256.01)4 mL按照1：1混合，充分混勻；將稀釋后的血標(biāo)本傾斜45°，貼壁、液面上方1 cm緩慢加至人血單個(gè)核細(xì)胞分離液(TBD，天津?yàn)蠊?，貨?hào)：LTS1077)的分離液中，TBD分離液與稀釋后的血標(biāo)本比例1：1；25 ℃，1500 r·min-1(r=15 cm)離心20 min，離心后取云霧層置入15 mL離心管中，加入5倍以上的PBS洗滌，充分搖勻，4 ℃、2000 r·min-1(r=15 cm)條件下再次離心8 min，后棄上清液，洗滌兩次，最后取沉淀物即PBMC。

1.4.2香煙煙霧提取物(cigaratte smoke extract,CSE)的制備 按XU 等[10]介紹的方法，將2 支去過濾嘴香煙于一個(gè)注射器驅(qū)動(dòng)裝置連續(xù)抽吸而燃，吸入的煙霧經(jīng)三通另一個(gè)出口通入50 mL無(wú)血清培養(yǎng)液中制成懸液。懸液用1 mmol·L-1氫氧化鈉(NaOH)調(diào)至pH值為7.4，經(jīng)孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過備用。制備的CSE于-40 ℃環(huán)境下凍存，解凍后在30 min 之內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.3PBMC刺激實(shí)驗(yàn)方案及指標(biāo)檢測(cè) 將1×106·mL-1PBMC加入RPMI 1640培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco 公司產(chǎn)品，貨號(hào)：17005042)4 mL中，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為3組，①CN組：無(wú)刺激劑；②CSE組：細(xì)胞中加入5% CSE；③CSE+NAC組：先用3 mmol·L-1NAC 預(yù)處理3 h，再用5%CSE刺激。以上操作完成后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，ELISA法測(cè)定上清液中IL-6、IL-8。每個(gè)處理組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。

2 結(jié)果

2.1患者入院基本情況 兩組患者在年齡、性別、吸煙狀況及肺功能水平方面均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩組間數(shù)據(jù)具有可比性。見表1。

表1 兩組患者基本情況比較Tab.1 Comparison of baseline data between two groups of patients

2.2兩組治療前后血清炎癥因子水平 治療組治療后血清IL-6、IL-8水平較治療前顯著下降(P<0.05或P<0.01)。而對(duì)照組IL-6、IL-8水平較治療前有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

2.3兩組治療前后肺功能指標(biāo)比較 兩組患者初始入組時(shí)的肺功能FEV1%pred數(shù)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。經(jīng)治療后，兩組患者的肺功能(FEV1%pred)水平均有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

2.4PBMC在刺激物作用后炎癥因子的影響 CSE刺激后IL-6的表達(dá)水平顯著升高，與CN組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.28，P<0.01)；而采用NAC預(yù)處理后，IL-6的表達(dá)水平明顯降低，與CSE組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.41，P<0.01)。CSE刺激后IL-8的表達(dá)水平顯著升高，與CN組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.50，P<0.01)；而采用NAC預(yù)處理后，IL-8的表達(dá)水平明顯降低，與CSE組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.33，P<0.01)。見圖3。

與本組治療前比較，*1 P<0.05，*2P<0.01。圖1 兩組患者治療前后血清炎癥因子比較Compared with the same group before treatment,*1P<0.05,*2P<0.01.Fig.1 Comparison of serum inflammatory cytokines between two groups of patients before and after treatment

圖2 兩組患者肺功能比較Fig.2 Comparison of lung function between two groups of patients

與CN組比較，*1P<0.01；與CSE+NAC組比較，*2P<0.01。圖3 PBMC在刺激物作用前后炎癥因子表達(dá)的比較compared with control group，*1P<0.01；compared with CSE+NAC group，*2P<0.01.Fig.3 Comparison of inflammatory cytokines in PBMC before and after stimulation

3 討論

目前全球40歲以上的人群COPD發(fā)病率為9%～10%，并隨著人口老齡化的加劇繼續(xù)上升[11]。近年來(lái)，COPD在我國(guó)15歲以上人群的發(fā)病率為3%，在40歲以上人群中達(dá)到13.7%[12]。氧化應(yīng)激、氧化抗氧化失衡和氣道慢性炎癥是COPD主要的發(fā)病原因。氧化抗氧化的失衡引起氣道上皮、平滑肌及肺泡壁的損傷，造成氣流受限[13]。然而，氧化抗氧化的失衡是否會(huì)導(dǎo)致炎癥因子的釋放，并導(dǎo)致氣道慢性炎癥的形成，目前并不十分清楚。

本研究結(jié)果顯示，給予NAC治療后炎癥因子IL-6和IL-8較治療前明顯降低，提示抗氧化治療可以降低COPD患者體內(nèi)炎癥因子的表達(dá)水平。IL-6和IL-8在COPD的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用，其表達(dá)水平的降低預(yù)示疾病嚴(yán)重程度降低。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明：NAC可以使大鼠炎癥減輕程度[14]。CALZETTA等[15]研究發(fā)現(xiàn)，采用人的分離的氣道通過給予NAC可以降低脂多糖刺激后的炎癥因子IL-6的表達(dá)，同時(shí)降低COPD急性加重的發(fā)生。

研究顯示，給予NAC治療后COPD患者的肺功能FEV1%pred增加，但相比基線差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。有研究結(jié)果表明，連續(xù)服用NAC共3年患者的FEV1 下降幅度明顯低于對(duì)照組，急性加重發(fā)生率和發(fā)作時(shí)間明顯下降(P<0.05)，證明COPD患者長(zhǎng)期服用NAC治療能減緩肺功能的下降[16]。而ZHENG等[17]研究發(fā)現(xiàn)大劑量NAC(1200 mg·d-1)可以明顯降低COPD急性加重的發(fā)生，但并沒有發(fā)現(xiàn)對(duì)肺功能的影響。本研究沒有觀察到對(duì)急性加重的影響，但肺功能有所改善。COPD以氣道和肺實(shí)質(zhì)的慢性炎癥為特征，通過釋放多種炎癥遞質(zhì)，激活炎癥細(xì)胞，促進(jìn)COPD的發(fā)生和發(fā)展[18]。NAC通過抑制上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞炎癥遞質(zhì)的釋放，減輕氣道炎癥，發(fā)揮潛在的抗炎作用[19-20]。而抗氧化作用通過降低COPD患者的炎癥反應(yīng)而延緩肺功能下降。

為進(jìn)一步研究COPD中的氧化/抗氧化與氣道慢性炎癥反應(yīng)之間的關(guān)系，筆者收集COPD患者的外周血，采用CSE刺激外周血淋巴細(xì)胞，并觀察細(xì)胞培養(yǎng)中加入NAC后對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NAC可以降低CSE刺激后的炎癥反應(yīng)。CSE的刺激可以導(dǎo)致氧化應(yīng)激，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)，而且氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞及組織損傷可使炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加劇，如此發(fā)生一系列鏈?zhǔn)交蜴準(zhǔn)街ф湻磻?yīng)[15]。

本研究從臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)及體外細(xì)胞試驗(yàn)角度同時(shí)證實(shí)，抗氧化治療可以通過降低COPD患者的炎癥水平而發(fā)揮作用。