楊文健，焦蓉，劉月，孫曉東，桑明

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院兒科，襄陽 441000)

膿毒癥是由多種炎癥因子過量產(chǎn)生并介導(dǎo)的全身性炎癥反應(yīng)的一類疾病[1]。嚴重的膿毒癥與感染性休克、全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)、多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)密切相關(guān)，更重要的是，心臟功能受損最為常見[1]。然而，膿毒癥病理生理學(xué)尚不完全清楚，治療方法有限。目前已知炎癥反應(yīng)參與膿毒癥心功能障礙的發(fā)生發(fā)展[2-3]。因此，找到有效的治療干預(yù)措施以抑制炎癥信號傳導(dǎo)，從而中斷細胞因子合成的惡性循環(huán)，可以最終抑制病情惡化。

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作為革蘭陰性細菌細胞壁的一種成分，可在被細菌感染的宿主中引起局部或全身炎癥反應(yīng)。Toll樣受體-4(Toll like receptor-4，TLR-4)是一種LPS受體，可以識別病原體相關(guān)的分子模式，對細胞信號傳導(dǎo)有著至關(guān)重要的作用[4]。雖然心肌細胞不是參與先天免疫的特異性細胞，但TLR-4可在心肌細胞中表達。TLRs在膿毒癥介導(dǎo)的心肌損傷中發(fā)揮重要作用，但是其機制尚不清楚。據(jù)報道，激活TLR-4導(dǎo)致MyD88(myeloid differentiation primary-response gene 88)募集，隨后激活下游絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)途徑[4]。MAPKs途徑的激活誘導(dǎo)促炎基因表達上調(diào)，并促進多器官功能障礙和SIRS的進展。因此，在心血管疾病中，MAPK信號通路可能是一個新的治療方向。

3,3′-二吲哚基甲烷(3，3′-diindolylmethane，DIM)，屬于吲哚-3-甲醇(indole-3-carbinol，I3C)的衍生產(chǎn)物，可從十字花科植物中提取，已證實具有抗血管生成、抗癌和抗肥大等作用[5-7]。此外，吲哚化合物在某些炎癥性疾病中具有抗炎作用[7]。然而，關(guān)于DIM對新生大鼠心肌細胞中LPS誘導(dǎo)的炎性損傷的作用知之甚少。因此，在本研究中，筆者首先觀察DIM是否具有抑制LPS誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細胞炎癥反應(yīng)的作用，并進一步探討了DIM對新生大鼠心肌細胞損傷保護作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基(GIBCO公司)，四季青胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司，批號：18040502)，CCK-8試劑盒(Dojindo，Kumamoto，Japan)，TRIzol試劑(Invitrogen，11667-165)，LPS(Sigma，L2630)。一抗包括ERK1/2(Cell Signaling Technology，4370)，p-ERK1/2(Cell Signaling Technology，4695)，P38(Cell Signaling Technology，9212)，p-P38(Cell Signaling Technology，4511)，T-JNK(Cell Signaling Technology，9258)，p-JNK(Cell Signaling Technology，4668)，TLR-4(Santa Cru Biotechnology，30002)和GAPDH(Santa Cru Biotechnology，25778)。二抗來自LI-COR Biosciences的山羊抗兔抗體(Lincoln，NE，USA)。DIM(通過高效液相色譜法分析測定含量為98%)購自上海醫(yī)療科技發(fā)展有限公司。

1.2設(shè)備 低溫離心機(Eppendorf Centrifuge 5804 德國)，電泳轉(zhuǎn)膜裝置(Bio-RAD，美國)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(泰州市華普達教學(xué)儀器有限公司)，Model 550 酶標儀(Bio-Rad，美國)；Bio Sen SC300 凝膠圖象分析系統(tǒng)(上海山富科學(xué)儀器有限公司)；Heal Force 生物安全柜(力康生物公司)；倒置熒光顯微鏡(Olympus 公司)，共聚焦顯微鏡(LEICA，SP5)，Smartspec Plus分光光度計(Bio-Rad)，ABI 7500儀器(Life Technologies，USA)。

1.3心肌細胞的分離和分組 新生大鼠心肌細胞獲自出生3 d內(nèi)的SD大鼠[8]。吸入二氧化碳(CO2)法處死新生大鼠。首先，將心臟置于冷DMEM/F12的直徑100 mm培養(yǎng)皿中，剪碎組織。心臟組織在于34 ℃、0.125%tryspin中消化15 min，輕輕搖動，重復(fù)消化5次，獲得單個細胞。收集所有消化液并以1000 r·min-1(r=42 cm)離心8 min。將這些細胞重新懸浮并通過直徑75 μm細胞過濾器濾過。最后將分離的細胞用含有15%FBS、1%青霉素(100 U·mL-1)和鏈霉素(100 mg·mL-1)的DMEM/F1培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞實驗分為4組：對照組、LPS組、DIM組和LPS+DIM組。細胞饑餓處理8 h后，再給予LPS和(或)DIM。

1.4CCK-8 通過CCK-8實驗檢測DIM對心肌細胞活性的影響。細胞(1×105·mL-1)接種在96孔中并培養(yǎng)48 h，每個濃度6個副孔。細胞饑餓處理8 h后，給予不同濃度的DIM(5，10，20和60 μmol·L-1)處理24 h。每孔加入CCK-8試劑10 μL孵育4 h，并用酶標儀(Bio-Tek，Synergy HT)在450 nm(吸收波長)和630 nm(參比波長)檢測吸光度。

1.5免疫熒光染色 本實驗通過標記α-肌動蛋白染色心肌細胞來觀察大鼠新生心肌細胞的形態(tài)。用溫磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，4%多聚甲醛(Sinopharm Chemical Reagent Co.，Ltd)固定15 min，0.2%Triton X-100(Amresco)透化后，用8%山羊血清封閉。然后用1%抗-α-肌動蛋白抗體(Millipore)1：100的稀釋液孵育過夜，再與山羊抗小鼠IgG二抗(Alexa Fluor 488)共孵育1 h，用含有DAPI的Slow Fade Gold抗褪色試劑固定在載玻片上。用定量數(shù)字圖像分析系統(tǒng)(Image Pro-Plus，6.0版)測量陽性細胞的數(shù)量。

1.6實時-熒光定量聚合酶鏈免疫反應(yīng)(RT-PCR)通過RT-PCR檢測細胞內(nèi)促炎遞質(zhì)的mRNA表達水平。向各組大鼠心肌細胞中加入適當(dāng)體積的TRIzol，提取RNA。根據(jù)說明書，通過分光光度計檢測RNA濃度，并使用Smartspec Plus分光光度計(Bio-Rad)使用A260/A280估算純度。使用oligo(dT)引物和Tran-scrptor First Strand cDNA合成試劑盒(Takara，047A)在20 μL反應(yīng)體積中用96孔熱循環(huán)儀(Applied Biosystems)將RNA(每個樣品2 μg)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix(Takara，04897030001)用ABI 7500儀器(Life Technologies，USA)定量PCR擴增，并檢測白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α和HMGB1相對mRNA表達水平。以下是PCR引物：IL-6正義鏈：5'-GTTGCCTTCT TGGGACTGATG-3'，反義鏈：5'-ATACTGGTCTGTTGTG GGTGGT-3';TNF-α正義鏈：5'-AGCATGATCCGAGTG-TGGAA-3'，反義鏈：5'-TAGACAGAAGAGCGTGGTGGC-3';HMGB1正義鏈：5'-TGCT GCATATCGAGC-TAAAGG-3'和反義鏈：5'-CCATACTGTACC AGG-CAAGGT-3';GAPDH：正義鏈：5'-GACATGCC-GCCTGGAGAA AC-3'，反義鏈：5'-AGCCCAGG-ATGCCCTTTAGT-3'。反應(yīng)在95 ℃下進行30 s，然后進行40個循環(huán)，在95 ℃下10 s，在60 ℃下34 s。

1.7Western blotting法檢測相關(guān)蛋白表達水平 利用蛋白質(zhì)印跡評估TLR-4、P38、p-P38、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK等相關(guān)蛋白質(zhì)的表達水平。向各組新生大鼠心肌細胞加入蛋白裂解液，提取蛋白質(zhì)，并用BCA蛋白質(zhì)測定試劑(Thermo，23225)檢測蛋白質(zhì)濃度。在還原條件下，在10%SDS/PAGE上分離凝膠中的蛋白質(zhì)樣品(30 μg)，然后使用凝膠轉(zhuǎn)移裝置(invitrogen)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。為了避免非特異性抗體結(jié)合的干擾，在室溫下用5%脫脂乳將PVDF膜封閉1.5 h。PVDF膜與TLR-4、P38、p-P38、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK及GAPDH的一抗在4 ℃孵育過夜，TBS洗脫后敷二抗。洗脫后采用電化學(xué)發(fā)光顯色，再進行定量分析。

2 結(jié)果

2.1DIM對新生大鼠心肌細胞活性的影響 利用CCK8實驗檢測不同濃度DIM(5，10，20和60 μmol·L-1)對新生大鼠心肌細胞活性的影響。結(jié)果見圖1。5，10，20 μmol·L-1DIM對新生大鼠心肌細胞沒有顯著的細胞毒性。然而，與對照組比較，大劑量DIM(60 μmol·L-1)作用的細胞活性顯著降低。提示60 μmol·L-1DIM對新生大鼠心肌細胞具有明顯的細胞毒性。為了減少DIM的非特異性細胞毒性，觀察了DIM對LPS誘導(dǎo)的炎癥損傷的影響。用LPS(10 mg·L-1)和不同濃度(5，10，20和60 μmol·L-1)的DIM共同與心肌細胞培養(yǎng)24 h。結(jié)果見圖1。LPS+DIM組(LPS+DIM 5，10，20 μmol·L-1)細胞活性高于LPS組。60 μmol·L-1DIM 組細胞存活率明顯降低。綜上，DIM作用濃度以20 μmol·L-1為宜。

2.2DIM對LPS誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細胞形態(tài)學(xué)改變的影響 利用免疫熒光顯微鏡觀察心肌細胞的形態(tài)學(xué)變化，鑒別DIM對LPS誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細胞形態(tài)學(xué)變化的影響。將心肌細胞與LPS(10 mg·L-1)和(或)DIM(20 μmol·L-1)共孵育24 h。對照組可觀察到正常心肌細胞呈梭形或不規(guī)則扁平狀，逐漸形成不規(guī)則星狀，利于與其他細胞形成交織。經(jīng)LPS處理后，心肌細胞體積變大，肌絲紊亂。經(jīng)過DIM治療后，LPS誘導(dǎo)的肌絲損傷得到改善。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明DIM可以改善LPS誘導(dǎo)的形態(tài)學(xué)變化，見圖2。

與對照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01。圖1 各組新生大鼠心肌細胞活性比較Compared with control group，*1P<0.05，*2P<0.01.Fig.1 Comparison of cell viability of cultured neonatal rat cardiomyocytes in all groups

2.3DIM顯著降低炎癥因子的mRNA水平 IL-6、TNF-α與LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[9-10]。研究證實，晚期促炎因子HMGB1亦與膿毒癥臨床結(jié)果密切相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)干擾HMGB1表達相對于干擾IL-6和TNF-α更有效。因此，檢測早期和晚期炎癥因子的mRNA表達水平，以觀察LPS誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細胞的炎癥損傷程度。見圖3，12 h后，LPS組早期促炎細胞因子的mRNA表達水平明顯增加。而LPS+DIM組IL-6和TNF-α的mRNA表達水平明顯低于LPS組。此外，與12 h比較，24 h細胞內(nèi)IL-6、TNF-α的表達水平明顯降低，而HMGB1的表達水平顯著增加。LPS+DIM組可降低晚期炎癥細胞因子HMGB1的基因水平。另外，與對照組比較，DIM組新生大鼠心肌細胞mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 各組新生大鼠心肌細胞的體外形態(tài)學(xué)變化(×200)Fig.2 In vitro morphological changes of cultured neonatal rat cardiomyocytes in all groups(×200)

2.4DIM通過TLR-4/MAPKs途徑發(fā)揮作用 TLR-4參與LPS激活的炎癥信號通路傳導(dǎo)[3]。研究表明，TLR-4可以激活下游MAPK通路，MAPK是驅(qū)動膿毒癥期間炎癥因子產(chǎn)生的關(guān)鍵遞質(zhì)[11-12]。MAPK由ERK1/2、P38和JNK組成。因此，在本研究中，探究TLR-4/MAPKs途徑是否參與DIM對LPS誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細胞炎癥損傷保護作用。利用Western blotting檢測TLR-4、ERK1/2、P38和JNK相關(guān)蛋白質(zhì)的表達水平。如圖4所示，膿毒癥組細胞TLR-4、p-ERK1/2、p-P38和p-JNK蛋白表達水平明顯升高。與LPS組比較，LPS+DIM組上述蛋白表達明顯減少。此外，對照組和DIM組之間的TLR-4、p-ERK1/2、p-P38和p-JNK水平?jīng)]有顯著差異。

3 討論

強大的炎癥反應(yīng)被視為膿毒癥重要的病理生理過程。LPS可與心肌細胞表面TLRs受體結(jié)合，激活體內(nèi)NF-κB信號通路，促使炎癥因子TNF-α、IL-6的表達，均可直接或間接抑制心肌細胞，導(dǎo)致細胞功能障礙；另一方面，炎癥因子進一步促進NF-κB信號通路激活，形成惡性循環(huán)，引發(fā)炎癥“風(fēng)暴”，導(dǎo)致細胞氧化應(yīng)激和細胞凋亡，導(dǎo)致多器官功能障礙甚至死亡[13-14]。LPS可導(dǎo)致早期促炎細胞因子的過量產(chǎn)生，包括IL-6和TNF-α[13]。IL-6被認為是膿毒癥和膿毒性休克的重要標志物，可預(yù)測疾病的發(fā)展及其嚴重程度。由心肌細胞分泌的TNF-α可誘導(dǎo)多種補體因子、一氧化氮合酶、細胞黏附分子、血小板活化因子和多種白細胞介素的產(chǎn)生，與心肌細胞表面相應(yīng)受體結(jié)合，啟動心肌線粒體凋亡通路，在發(fā)病早期中起關(guān)鍵作用[1，15-16]。早期促炎癥因子(TNF-α和IL-1β)在早期收縮功能下降中起關(guān)鍵作用，但不能解釋膿毒癥的長期心肌功能障礙的原因[13]。膿毒癥的臨床結(jié)果與晚期HMGB1遞質(zhì)的水平變化密切相關(guān)，而不是LPS誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6等早期炎癥遞質(zhì)。因此，HMGB1是治療敗血癥的更有效靶點。本研究結(jié)果顯示，DIM可以降低LPS誘導(dǎo)的IL-6、TNF-α和HMGB1的mRNA水平，提示DIM可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的促炎因子的產(chǎn)生。

TLR-4在心肌細胞表面表達，在LPS誘導(dǎo)的炎癥損傷中起重要作用。TLR4可識別LPS，通過MYD88依賴性途徑引起NF-κB入核，啟動炎癥因子轉(zhuǎn)錄[17]，亦可激活下游MAPKs途徑[18]。因此，本實驗觀察了TLR-4/MAPKs信號通路是否參與了DIM對新生大鼠心肌細胞炎癥損傷的保護作用，結(jié)果顯示DIM顯著抑制TLR-4、p-ERK1/2、p-P38和p-JNK等蛋白水平。因此，TLR-4/MAPKs信號通路參與DIM對新生大鼠心肌細胞炎癥損傷的保護作用，進而抑制促炎細胞因子IL-6，TNF-α和HMGB1的過量產(chǎn)生。

與對照組比較，*1P<0.05；與LPS組比較，*2P<0.05。圖3 各組心肌IL-6、TNF-α和HMGB1的mRNA表達水平Compared with control group，*1P<0.05；compared with LPS group，*2P<0.05.Fig.3 The mRNA expression levels of IL-6,TNF-α and HMGB1 of cardiomyocytes in all groups

本研究結(jié)果為治療膿毒癥提供了新的治療靶點，但本實驗只檢測了炎癥指標，未檢測氧化應(yīng)激水平，沒有體現(xiàn)心功能的變化及DIM對膿毒癥動物模型生存率的影響，因此存在一定的局限性，需進一步進行動物實驗驗證細胞實驗所得結(jié)論。

綜上所述，DIM可以通過抑制TLR-4/MPAKs信號通路降低心肌細胞內(nèi)炎癥因子水平，對LPS誘導(dǎo)的新生大鼠炎癥損傷心肌細胞具有保護作用。今后將進一步完善相關(guān)實驗，探討DIM對膿毒癥的更多作用及其機制，為DIM預(yù)防膿毒癥展示更廣闊的前景。

與對照組比較，*1P<0.05；與LPS組比較，*2P<0.05。圖4 DIM抑制LPS激活的TLR-4 /MAPKs信號通路Compared with control group,*1P<0.05；compared with LPS group，*2P<0.05.Fig.4 Inhibition of DIM on LPS-induced TLR-4/MAPKs signaling pathways