張敏，董嘉皓，李斐，肖素蕓，袁金斌

(1.南昌市食品藥品檢驗(yàn)所南昌市中藥質(zhì)控與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330015；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330004；3.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥學(xué)科研實(shí)踐班，南昌 330004)

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸[Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.]、石虎[Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang]或疏毛吳茱萸[Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang]的干燥近成熟果實(shí)[1]。吳茱萸性味辛、苦、熱，有小毒；具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽(yáng)止瀉等功效?，F(xiàn)代研究表明，吳茱萸中含有多種化學(xué)成分，主要為生物堿類、檸檬苦素類、揮發(fā)油類、木脂素、黃酮、多糖等[2]，其中生物堿類為其主要有效成分，具有鎮(zhèn)痛、抗炎等藥理作用[3-4]。

吳茱萸生物堿類成分眾多，主要包括吲哚喹啉類和喹諾酮類生物堿。目前關(guān)于吳茱萸質(zhì)量控制方面的研究多集中于吲哚喹啉類生物堿(如吳茱萸堿和吳茱萸次堿)的含量測(cè)定[1，5-10]，較少涉及其他生物堿。文獻(xiàn)表明去氫吳茱萸堿和吳茱萸新堿是吳茱萸所特有的生物活性成分[2，10]，筆者前期研究發(fā)現(xiàn)二者的含量相對(duì)較高[11-13]，在討論吳茱萸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量控制方法時(shí)，有必要將二者列入考慮范圍。

本實(shí)驗(yàn)擬以去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸新堿為含測(cè)指標(biāo)，通過(guò)優(yōu)化高效液相色譜(HPLC)條件，建立一種同時(shí)測(cè)定吳茱萸生物堿的方法，并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)驗(yàn)證，以期為研究吳茱萸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供前期研究基礎(chǔ)，為吳茱萸藥材及其飲片的質(zhì)量控制提供可靠的分析方法。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260 series高效液相色譜儀(包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器)；Mettler AE 240電子天平(瑞士Mettler公司，感量：0.000 1 g)；PS-80A超聲波清洗機(jī)(東莞市潔康超聲波設(shè)備有限公司)；GZX-9140MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；116B搖擺式高速中藥粉碎機(jī)(瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司)。

1.2試藥 吳茱萸藥材采自江西省新干市，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)曹嵐副教授鑒定為蕓香科植物石虎[Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang]的干燥近成熟果實(shí)。去氫吳茱萸堿對(duì)照品購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司(批號(hào)：B21028)，吳茱萸新堿對(duì)照品購(gòu)自上海胤珂生物科技有限公司(批號(hào)：15266-38-3)，吳茱萸堿對(duì)照品(批號(hào)：110802-200504)、吳茱萸次堿對(duì)照品(批號(hào)：0801-9702)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。所有對(duì)照品標(biāo)示含量均大于98.5%(HPLC分析)。乙腈為色譜純，水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取各對(duì)照品適量，以甲醇溶解并定容，得單一成分對(duì)照品溶液。再分別取上述4個(gè)對(duì)照品溶液各1 mL加入10 mL量瓶中，以甲醇定容，搖勻，得混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液?；鞓?biāo)溶液中，各對(duì)照品的濃度分別為：去氫吳茱萸堿503 μg·mL-1、吳茱萸堿501 μg·mL-1、吳茱萸次堿503 μg·mL-1和吳茱萸新堿511 μg·mL-1。

2.2供試品溶液的制備 吳茱萸藥材凈制，放入60 ℃烘箱，烘2 h，粉碎，稱取約0.3 g(過(guò)孔徑355 μm篩)，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25mL，稱定質(zhì)量，浸泡1 h后超聲處理(功率100 W，頻率40 kHz)40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，過(guò)孔徑0.22 μm濾膜，備用。

2.3色譜條件 Agilent Zorbax Eclipse Plus-C18色譜柱(4.6 mm×100 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)；梯度洗脫：0～10 min，17%→21%A；10～12 min，21%→40%A；12～15 min，40%→44%A；15～17 min，44%A；17～18 min，44%→60%A；18～28 min，60%→75%A；28～30 min，75%→100%A；30～35 min，100%A。流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：326 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

2.4系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)及專屬性考察 將混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白溶劑分別按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣檢測(cè)，色譜圖見(jiàn)圖1?？芍?，空白溶劑在去氫吳茱萸堿峰、吳茱萸堿峰、吳茱萸次堿峰和吳茱萸新堿峰位置處均無(wú)吸收峰，即溶劑對(duì)測(cè)定無(wú)干擾；供試品溶液中，4種組分峰均與其他組分峰達(dá)到基線分離，分離度>1.5，且與混合對(duì)照品溶液中4種組分峰的保留時(shí)間一致。

2.5線性關(guān)系考察 逐級(jí)稀釋“2.1”項(xiàng)混合對(duì)照品溶液，得6個(gè)濃度系列的混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣分析。以濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸分析。得回歸方程分別為：去氫吳茱萸Y=9808.2X-23.844(R2=0.999 5)，吳茱萸堿堿Y=1691.6X-3.8455 (R2=0.999 5)，吳茱萸次堿Y=29413X+6.062 7(R2=0.999 7)，吳茱萸新堿Y=8259.8X-4.184 7(R2=0.999 7)。去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸新堿的線性范圍分別為2.52～503，2.50～501，2.52～503和2.56～511 μg·mL-1。

2.6精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取供試品溶液5 μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，以峰面積計(jì)算RSD值，得去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸新堿的RSD值分別為0.7%，0.6%，0.5%，0.8%。

2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批吳茱萸藥材6份，按“2.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法和“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算含量，以 6次含量的RSD評(píng)價(jià)方法的重復(fù)性。去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸新堿RSD值分別為1.0%，1.1%，1.6%，1.3%。

2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取吳茱萸粉末，制備，分別室溫下靜置0，2，4，6，12，24，48 h后再按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積計(jì)算RSD值，去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸新堿RSD值分別為1.1%，0.8%，1.0%，1.1%。

2.9加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取己知含量的同一吳茱萸粉末6份，分別精密加入相當(dāng)于樣品100%含量的去氫吳茱萸堿(0.313 mg·mL-1)、吳茱萸堿(0.456 mg·mL-1)、吳茱萸次堿(0.235 mg·mL-1)和吳茱萸新堿(0.146 mg·mL-1)的對(duì)照品1 mL，制備，按上述的色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算加樣回收率。其平均回收率(RSD)分別為：去氫吳茱萸堿，98.4%(2.4%)；吳茱萸堿98.7%(2.4%)；吳茱萸次堿，100.9%(2.4%)和吳茱萸新堿，101.1%(2.4%)。

2.10不同產(chǎn)地樣品的含量測(cè)定 取不同產(chǎn)地的吳茱萸藥材10批，分別按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法和“2.2”項(xiàng)下色譜條件制備和進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖2。10批不同產(chǎn)地吳茱萸中4種成分的含量結(jié)果見(jiàn)表1。

A.空白溶劑；B.對(duì)照品；C.供試品；1.去氫吳茱萸堿；2.吳茱萸堿；3.吳茱萸次堿；4.吳茱萸新堿。圖1 3種溶液的HPLC色譜圖A.blank solution；B.reference；C.samples；1.dehydroevodiamine;2.evodiamine;3.rutaecarpin;4.evocarpine.Fig.1 HPLC chromatogram of three kinds of solution

S1.江西樟樹(shù)1；S2.江西樟樹(shù)2；S3.江西豐溪1；S4.江西豐溪2；S5.江西新干；S6.湖南新晃；S7.湖南沅江；S8.云南昭通；S9.云南曲靖；S10，貴州凱里；1.去氫吳茱萸堿；2.吳茱萸堿；3.吳茱萸次堿；4.吳茱萸新堿。圖2 不同產(chǎn)地的吳茱萸色譜圖S1.Zhangshu 1,Jiangxi;S2.Zhangshu 2,Jiangxi;S3.Fengxi 1,Jiangxi;S4.Fengxi 2,Jiangxi;S5.Xingan,Jiangxi;S6.Xinhuang,Hunan;S7.Yuanjiang,Hunan;S8.Zhaotong,Yunnan;S9.Qujing,Yunnan;S10.Kaili,Guizhou;1.dehydroevodiamine;2.evodiamine;3.rutaecarpin;4.evocarpine.Fig.2 Chromatograms of Euodia rutaecarpa from different origins

表1 10批不同產(chǎn)地吳茱萸4種生物堿含量測(cè)定結(jié)果Tab.1 Results of content determination on ten batches of four alkaloids in Euodia Rutaecarpa from different origins %，n=6

3 討論

3.1流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)考察乙腈-0.2%甲酸溶液、乙腈-0.2%醋酸溶液和乙腈-0.1%磷酸溶液，發(fā)現(xiàn)在乙腈-0.1%磷酸溶液下4種成分的色譜峰分離效果較好，可達(dá)到完全分離，且出峰時(shí)間適中。因此選用了乙腈-0.1%磷酸溶液為本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相。

3.2提取溶劑的選擇 吳茱萸生物堿是脂溶性化合物，易溶于有機(jī)溶劑，如乙醇、甲醇、乙酸乙酯溶液等。從環(huán)境友好和經(jīng)濟(jì)適用的角度看，乙醇是最佳的提取溶劑。前期實(shí)驗(yàn)[10]表明吳茱萸生物堿進(jìn)行提取用濃度為70%的乙醇，生物堿得率最高。因此，本實(shí)驗(yàn)使用的提取溶劑為70%乙醇。

3.3檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 文獻(xiàn)中有關(guān)吳茱萸堿和吳茱萸次堿的檢測(cè)波長(zhǎng)多設(shè)置為215和225 nm[8-10]，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)波長(zhǎng)設(shè)置為215和225 nm時(shí)，吳茱萸堿和吳茱萸次堿中有個(gè)小峰，使二者的分離度均小于1.5，且基線漂移較大。當(dāng)以DAD檢測(cè)器在190～400 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描時(shí)發(fā)現(xiàn)該雜質(zhì)峰在326 nm處無(wú)吸收，而4個(gè)目標(biāo)化合物均有合適的響應(yīng)，且色譜圖的基線平穩(wěn)，各色譜峰峰的分離度都大于1.5，故檢測(cè)波長(zhǎng)選擇為326 nm。

3.4不同產(chǎn)地樣品的含量分析 從圖2和表1可知，不同產(chǎn)地吳茱萸中化學(xué)成分含量的差異較大。其中吳茱萸堿和次堿在各個(gè)樣品中的含量差異最大，去氫吳茱萸堿含量差異相對(duì)較小。按《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版標(biāo)準(zhǔn)，樟樹(shù)1#和豐溪的3個(gè)樣品竟為不合格產(chǎn)品，具體原因尚需進(jìn)一步調(diào)查取樣。

吲哚喹啉類、喹諾酮類生物堿是吳茱萸中的兩類主要生物堿，去氫吳茱萸堿、吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸新堿是這兩類生物堿的典型代表，特征性強(qiáng)，含量相對(duì)比較豐富。筆者首次將代表喹諾酮類生物堿的吳茱萸新堿納入到吳茱萸的含測(cè)指標(biāo)，更能反映吳茱萸藥材的質(zhì)量屬性。

在充分優(yōu)化分析條件的基礎(chǔ)上，本文建立了吳茱萸中4種生物堿的HPLC同時(shí)測(cè)定方法，并對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的方法學(xué)驗(yàn)證。該方法簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、可靠，可用于吳茱萸藥材及其飲片的質(zhì)量評(píng)價(jià)。