吳海燕 王純結(jié) 敖日格樂 姜 艷 裴大偉

1.內(nèi)蒙古自治區(qū)興安盟科爾沁右翼前旗動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古興安盟科右前旗137400；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，呼和浩特010018

奶牛乳房炎主要由金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌等致病菌引起[1-2]。目前治療奶牛乳腺炎首選抗生素，但隨著耐藥菌株的不斷增多和耐藥性的不斷變化，抗生素的殘留問題日益突出[3]，迫切需要一種安全、綠色的奶牛乳腺炎治療方法。蒙藥由純天然的礦植物組成，含有多種生物有效成分。本研究通過對患有奶牛場乳房炎的牛奶樣中分離出的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，初步探討奶牛乳房炎主要致病菌的耐藥特征并比較2 種蒙藥與抗生素抗菌差異，為該蒙藥復(fù)方的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1）奶樣采集。奶樣采自呼和浩特市周圍奶牛場50頭患有臨床型乳房炎的奶牛。用溫水清洗乳房，擦干后用2 g/L 的新潔爾滅和酒精棉對奶牛乳房進(jìn)行消毒，棄去前2～3 把奶，每頭采奶樣約4 mL 于滅菌的離心管中，加蓋封緊，標(biāo)明牛號(hào)。

2）培養(yǎng)基及試劑。營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美蘭培養(yǎng)基、高鹽甘露醇培養(yǎng)基、5%綿羊鮮血瓊脂平板、血清平板，均按說明書配制；藥敏紙片和生化鑒定所用的微量發(fā)酵管，以上均購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司。

3）試驗(yàn)儀器。HPS-250 生化培養(yǎng)箱、FLC-3 超凈工作臺(tái)、BP211D 電子天平、全不銹鋼立式高壓滅菌鍋。

1.2 試驗(yàn)方法

1）奶牛乳房炎病原菌分離、鑒定試驗(yàn)。將采集的乳樣分別在普通瓊脂平板、5%綿羊鮮血瓊脂平板、伊紅美藍(lán)瓊脂平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)(37 ℃,24 h)，觀察細(xì)菌菌落生長情況，并進(jìn)行涂片、鏡檢和純培養(yǎng)[4]。根據(jù)細(xì)菌生化鑒定試劑盒說明進(jìn)行生化鑒定。

2）蒙藥復(fù)方藥敏試驗(yàn)。將金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h。用營養(yǎng)肉湯校正濃度至0.5 麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，約含1×108～2×108CFU/mL。將其稀釋100 倍至1×106～2×106CFU/mL。用“L”型涂菌棒均勻涂布于整個(gè)培養(yǎng)基表面。用置杯器放置牛津杯，分別將100 μL 藥液加入制備好的帶有菌層平皿中的牛津杯內(nèi)，蓋好，37 ℃培養(yǎng)24 h。游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。大于15 mm 為極度敏感；大于10 mm 且小于15 mm 為高度極敏；大于8 mm 且小于10 mm 為敏感；小于8 mm 為不敏感[5]。

3）抗生素藥敏試驗(yàn)。紙片擴(kuò)散法(K-B 法)，將分離菌純化后進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，37 ℃,24 h 培養(yǎng)后測量各種藥物的抑菌環(huán)直徑。試驗(yàn)結(jié)果判定：參照NCCLS (2007)公布的標(biāo)準(zhǔn)以敏感(susceptible)、中敏(intermediate)和耐藥(resistant)3 種形式對抑菌圈大小進(jìn)行分類。耐藥率=耐藥菌株數(shù)/試驗(yàn)菌株數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 常見致病菌的分離鑒定

1）培養(yǎng)及染色特性。奶牛乳房炎病原菌培養(yǎng)顯示，A 類菌呈單個(gè)，短粗，菌體較小，革蘭氏染色反應(yīng)為陰性，在伊紅美藍(lán)上形成黑色有金屬光澤、光滑、濕潤、隆起的中等大小菌落，在普通瓊脂和血瓊脂上為圓形乳白色菌落。B 類菌呈圓形或橢圓形，較大，單個(gè)或成對，個(gè)別有四聯(lián)球菌，革蘭氏染色反應(yīng)為陽性，在普通瓊脂和血瓊脂上生長良好，形成金黃色或白色小菌落，金黃色菌落在血瓊脂上呈明顯的溶血，白色菌落在血瓊脂上不溶血。C 類菌呈圓形，革蘭氏染色反應(yīng)為陽性，成短鏈狀排列，在普通瓊脂上為白色或灰白色細(xì)小菌落。在血瓊脂上為灰白色半透明、隆起、粘稠的小菌落，有的有明顯的β溶血。

2）動(dòng)物試驗(yàn)。注射鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的小鼠初期出現(xiàn)肌肉震顫、精神沉郁等癥狀，以后精神逐漸恢復(fù)，48 h 內(nèi)有3 只死亡，用培養(yǎng)基回收到攻毒菌。

3）生化鑒定。將分離到的36 個(gè)菌株進(jìn)行純培養(yǎng)并采用生化試驗(yàn)進(jìn)行鑒定，結(jié)果見表1～表3，表1～表3中，“+”表示陽性，“-”表示陰性。

表1 A 類菌株生化反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

表2 B 類菌株生化反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

表3 C 類菌株生化反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

表4 蒙藥復(fù)方藥敏試驗(yàn)結(jié)果（抑菌圈直徑M±S）

根據(jù)培養(yǎng)、形態(tài)、染色以及生化試驗(yàn)結(jié)果及參考文獻(xiàn)[6]，可初步判定所分離菌中A 類為大腸桿菌，B 類為金黃色葡萄球菌，C 類為鏈球菌（C1 無乳鏈球菌，C2 為停乳鏈球菌）。對所分離病原菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果為：從50 份樣品中分離細(xì)菌，經(jīng)培養(yǎng)特性、染色鏡檢、生化鑒定等試驗(yàn)，鑒定出無乳鏈球菌13 株，占分離菌的27%，大腸桿菌17 株，占分離菌的35%，金黃色葡萄球菌18 株，占分離菌的37%。其中，9 份乳樣則未檢出細(xì)菌，可能為非特異性乳房炎或者是由其他病原微生物引起。

2.2 蒙藥復(fù)方藥敏試驗(yàn)

對分離到的致病菌進(jìn)行傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方和正交蒙藥復(fù)方藥敏試驗(yàn)。由表4可知，正交蒙藥復(fù)方和傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方對金葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌的抑菌圈均大于15 mm，為極敏感，有效地抑制病原菌的生長。2 種蒙藥復(fù)方之間無顯著性差異（ ＞0.05）。

2.3 抗生素藥敏試驗(yàn)

選擇性對分離到的致病菌株進(jìn)行了5 類共11種藥物敏感試驗(yàn)。由表5可見，大腸桿菌對慶大霉素、卡那霉素、環(huán)丙沙星、阿米卡星、鏈霉素等藥物高度敏感；對克林霉素、紅霉素、四環(huán)素等藥物中度敏感；對青霉素、阿莫西林、頭孢噻吩等藥物不敏感，耐藥率達(dá)到94%以上。金黃色葡萄球菌對慶大霉素、卡那霉素、環(huán)丙沙星、阿米卡星等藥物高度敏感；對鏈霉素、四環(huán)素、紅霉素等藥物中度敏感或不敏感；對青霉素、阿莫西林、克林霉素、頭孢噻吩等藥物耐藥率分別為100%、88.9%、94.4%、94.4%。而鏈球菌對慶大霉素和阿米卡星高度敏感；對卡那霉素、四環(huán)素、紅霉素、阿莫西林、環(huán)丙沙星、頭孢噻吩等中度敏感；對青霉素及克林霉素、鏈霉素不敏感，耐藥率達(dá)到84.6%以上。

3 討 論

導(dǎo)致奶牛乳房炎的病原微生物種類繁多，有細(xì)菌、真菌、病毒、支原體等，但95%以上都是由細(xì)菌引起的[7-8]。本研究經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)特性、形態(tài)染色特性、生化特性等鑒定表明，50 份奶樣中共分離到48 個(gè)菌株，其中A 類17 個(gè)菌株為大腸桿菌，占分離菌的35%；B 類18 個(gè)菌株為金黃色葡萄球菌，占分離菌的37%；C 類13 個(gè)菌株則為鏈球菌，占分離菌的27%。本試驗(yàn)分離鑒定的細(xì)菌種類及所占的比例情況，與其他文獻(xiàn)報(bào)道的其他地區(qū)奶牛乳房炎細(xì)菌鑒定結(jié)果略有不同[9-10]，其原因可能是由于各地氣候、地理位置以及不同地區(qū)牛場的衛(wèi)生管理措施存在差異有關(guān)。

當(dāng)長期應(yīng)用抗菌藥物時(shí)，敏感菌株不斷被殺滅，耐藥菌株不斷大量繁殖，代替敏感菌株，促使細(xì)菌對抗菌藥物的耐藥率不斷升高。本研究抗生素藥敏驗(yàn)結(jié)果表明，鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌有較強(qiáng)的抑菌效果，尤其是卡那霉素效果突出。β-內(nèi)酰胺類中青霉素類藥物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌抑菌效果不明顯。頭孢噻吩對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌效果較差，克林霉素對金黃色葡萄球菌和鏈球菌的抑菌活性較差，大環(huán)內(nèi)酯類的紅霉素對鏈球菌，金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌作用，環(huán)丙沙星對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑菌作用。劉大成等[11]報(bào)道金黃色葡萄球菌對四環(huán)素、慶大霉素、卡那霉素等藥物高度敏感；鏈球菌對紅霉素、喹諾酮類以及慶大霉素等均高度敏感，大腸桿菌對四環(huán)素、慶大霉素、喹諾酮類等均高度敏感，而對青霉素均產(chǎn)生了不同程度的耐藥性；與本試驗(yàn)結(jié)果基本相符。鄧海平等[12]報(bào)道，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌對青霉素、紅霉素具有較強(qiáng)的耐藥性，對環(huán)丙沙星、慶大霉素較為敏感，本試驗(yàn)結(jié)果與其基本相符。

表5 抗生素藥敏試驗(yàn)結(jié)果

蒙藥復(fù)方藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，2 種蒙藥復(fù)方對所分離的病原菌有較好的抑制作用，為蒙藥治療奶牛乳房炎提供了有力的依據(jù)。隨著抗生素耐藥性的日趨增強(qiáng)，急需開發(fā)能夠替代抗生素，且毒副作用小、無殘留的產(chǎn)品。有研究表明，蒙藥制劑不但能夠直接抑殺病原微生物，而且能夠提高機(jī)體的免疫機(jī)能。因此，蒙藥在治療乳房炎方面具有很大發(fā)展前景。