魁國菊,禹 樂,朱啟淦,陳藝錦,楊立民,任紅岳,孟加榕

*(聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○九醫(yī)院,廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院病理科,漳州 363000;*通訊作者,E-mail:Mengjiarong@sina.com)

肺癌是當(dāng)前世界各國常見的惡性腫瘤之一。目前,肺癌不僅在歐美等發(fā)達(dá)國家居惡性腫瘤發(fā)病率及死亡率之首[1,2],也已成為我國城市居民死亡率第1位的惡性腫瘤,且有逐年上升的趨勢[3]。近年來,肺癌又以非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)為主,約占所有肺癌的80%-85%[4]。傳統(tǒng)治療以手術(shù)、放化療為主。2004年美國哈佛醫(yī)學(xué)院的研究人員Paez[5]及Lynch[6]分別提出表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)發(fā)生基因突變的非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)對EGFR酪氨酸激酶抑制劑有高度敏感性。2016版的《中國非小細(xì)胞肺癌患者表皮生長因子受體基因突變檢測專家共識》明確指出,所有NSCLC患者均應(yīng)進(jìn)行EGFR基因熱點(diǎn)突變檢測[7]。目前,檢測EGFR基因突變的標(biāo)本對組織固定、透明脫蠟制作石蠟切片和提取組織中DNA的脫蠟要求嚴(yán)苛,固定及脫蠟效果直接影響檢測的結(jié)果,而傳統(tǒng)脫蠟用的二甲苯為無色透明的液體,易揮發(fā),有毒,長期使用有害身體健康,故尋找一種替代試劑用于組織脫蠟顯得尤為必要,本研究旨在探討使用GS環(huán)保脫蠟液替代二甲苯的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

選取聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○九醫(yī)院2017-10～2018-10臨床送檢肺癌標(biāo)本,經(jīng)HE染色和免疫組化確診為肺腺癌病例16例,其中肺組織標(biāo)本5例,肺穿刺組織標(biāo)本6例,纖支鏡標(biāo)本5例。標(biāo)本采用常規(guī)程序用二甲苯進(jìn)行石蠟脫蠟處理檢測獲得EGFR基因突變陽性病例11例(19-Del病例5例,L858R病例5例,19-Del和T790M雙突變病例1例),野生型病例5例。

1.2 試劑

核酸提取試劑盒(FFPE DNA，廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司)；人類EGFR基因突變熒光PCR檢測試劑盒(廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司)；二甲苯替代試劑為GS環(huán)保脫蠟液Ⅰ、Ⅱ(哈爾濱格林標(biāo)本技術(shù)開發(fā)有限公司)。

1.3 儀器

ABI 7500 Real Time PCR System(ABI公司);Amoydx-Giraffe紫外分光光度計(jì)SMA4000(廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 DNA提取 根據(jù)福爾馬林固定石蠟包埋切片(FFPE)組織面積的大小,刮取1-5片3-6 μm FFPE樣品(同一標(biāo)本切取2份蠟片厚度、片數(shù)一致樣品)至1.5 ml離心管中,其中一份加入GS環(huán)保試劑脫蠟液Ⅰ 1 ml,振蕩混勻10 s;室溫12 800 r/min離心5 min,小心去除上清(勿吸到沉淀);加入GS環(huán)保試劑脫蠟液Ⅱ 1 ml,振蕩混勻10 s;室溫12 800 r/min離心5 min,小心去除上清(勿吸到沉淀);加入1 ml無水乙醇,振蕩混勻10 s,室溫12 800 r/min離心5 min,小心去除上清(勿吸到沉淀);室溫開蓋或37 ℃開蓋放置,使乙醇充分揮發(fā)。再用核酸提取試劑盒(FFPE DNA)提取DNA。將提取好的DNA樣品通過紫外分光光度計(jì)測定DNA濃度,將DNA濃度稀釋至1.5 ng/μl,濃度低于1.5 ng/μl的樣品直接取原液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。另一份樣品采用常規(guī)程序用二甲苯進(jìn)行石蠟切片脫蠟處理做對照。

1.4.2 突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(amplication refraction mutation system,ARMS)法檢測EGFR 采用ADx-ARMS人類EGFR基因21種突變檢測試劑盒,檢測EGFR基因外顯子18,19,20,21共21種權(quán)威機(jī)構(gòu)提供的已知常見突變。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,兩種方法提取的DNA合格率差異采用χ2檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 提取DNA合格率的比較

16例石蠟標(biāo)本均采用GS環(huán)保試劑、二甲苯脫蠟,兩者所提取的DNA合格率均為100%,DNA含量、質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表1)。

表1 GS環(huán)保試劑與二甲苯脫蠟標(biāo)本DNA提取液的合格率的比較

Table 1 Comparison of qualification rate of DNA extract between environmental reagent GS and xylene dewaxing for the same paraffin-embedded specimen

試劑類型n合格不合格合格率(%)二甲苯16160100GS環(huán)保試劑16160100

樣本DNA合格表示所獲取的DNA樣本濃度均大于2 ng/μl,DNA且蛋白質(zhì)含量的比值OD260/OD280在1.6-2.2之間

2.2 EGFR基因突變狀態(tài)結(jié)果比較

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,16例石蠟標(biāo)本,用GS環(huán)保試劑進(jìn)行石蠟脫蠟處理檢測獲得EGFR基因突變陽性病例11例,其中19-Del病例5例,L858R病例5例,19-Del和T790M雙突變病例1例,野生型病例5例,與用二甲苯脫蠟處理檢測獲得的EGFR基因突變結(jié)果完全一致(見表2)。

表2 二甲苯與GS環(huán)保試劑脫蠟同一標(biāo)本的EGFR突變結(jié)果的比較

Table 2 Comparison of EGFR mutation results between environmental reagent GS and xylene dewaxing for the same paraffin-embedded specimen

試劑類型n19-Del突變(例)L858R突變(例)19-del和T790M雙突變(例)突變率(%)二甲苯1655168.8GS環(huán)保試劑1655168.8

2.3 EGFR基因突變類型

16例用GS環(huán)保脫蠟液脫蠟的標(biāo)本檢測出的EGFR基因突變類型均與其二甲苯脫蠟的標(biāo)本完全一致(見圖1)。

A和B，C和D，E和F分別為同一石蠟標(biāo)本圖1 同一標(biāo)本使用GS環(huán)保試劑與二甲苯脫蠟的EGFR基因突變類型對比Figure 1 Comparison of EGFR gene mutation types between environmental reagent GS and xylene dewaxing for the same paraffin-embedded specimen

結(jié)果表明,GS環(huán)保脫蠟液脫蠟效果好,能夠代替二甲苯應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變檢測,并符合實(shí)驗(yàn)室環(huán)保的要求。

3 討論

肺癌是當(dāng)前國內(nèi)外最常見的惡性腫瘤之一。目前推崇分子靶向治療,EGFR突變狀態(tài)是反映EGFR-TKI靶向治療療效的標(biāo)志物,在進(jìn)行靶向個體化治療前必須進(jìn)行EGFR基因突變的檢測[8]。檢測EGFR基因突變的標(biāo)本以手術(shù)切除標(biāo)本、活檢標(biāo)本為主,其組織固定、透明脫蠟制作石蠟切片和提取組織中DNA的脫蠟是進(jìn)行腫瘤標(biāo)本EGFR基因突變檢測的基礎(chǔ),固定及脫蠟效果直接影響檢測的結(jié)果。

由于二甲苯能很好地溶解石蠟,所以在病理組織制片過程中,二甲苯是首選的脫蠟劑。目前,大部分分子病理檢查都是基于PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的,由于PCR實(shí)驗(yàn)的本質(zhì)是體外酶促合成特異性DNA片段,因此從石蠟包埋組織中提取優(yōu)質(zhì)的DNA顯得尤為重要。二甲苯作為傳統(tǒng)脫蠟液一直被廣泛采用。二甲苯為無色透明有特殊氣味的液體,是由間二甲苯、對二甲苯和鄰二甲苯組成的芳香烴,具有高毒性,易揮發(fā)等缺點(diǎn),既會對環(huán)境造成污染,又對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有麻醉作用,對眼及呼吸道有明顯的刺激癥狀,可通過呼吸道吸入或皮膚接觸進(jìn)入體內(nèi)后,能夠引起神經(jīng)系統(tǒng)和血液系統(tǒng)損害,長期接觸還可引起神經(jīng)衰弱綜合征和植物神經(jīng)紊亂以及皮膚黏膜刺激癥狀,甚至可造成免疫功能低下、貧血、白細(xì)胞減少、皮炎、濕疹和皮膚干燥,尿中也可以出現(xiàn)蛋白管型等[9],應(yīng)盡可能避免使用。因此不少學(xué)者探討用其他試劑代替二甲苯,較早有研究用松節(jié)油[10]代替二甲苯作為常規(guī)石蠟切片用脫蠟液,但是單純的松節(jié)油透明和脫蠟效果遠(yuǎn)不及二甲苯,而且使用久了會變得黏稠。目前,國內(nèi)外用無醛無苯環(huán)保試劑進(jìn)行組織處理及制片的相關(guān)報(bào)道較多[11-15]。但在非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變檢測方面的應(yīng)用中,目前只查到陳志強(qiáng)等[16]報(bào)道的一篇。

為了克服二甲苯在使用中存在的上述不足,我們嘗試使用一種無色、無味、非苯類無毒性的安全環(huán)保型脫蠟液替代二甲苯。本研究比較了GS環(huán)保脫蠟液和傳統(tǒng)二甲苯的脫蠟效果,兩者在提取DNA的合格率上均達(dá)到100%,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行EGFR基因突變檢測,發(fā)現(xiàn)用GS環(huán)保脫蠟液脫蠟的標(biāo)本檢測出的EGFR突變狀態(tài)與二甲苯脫蠟的標(biāo)本一致,EGFR突變的類型顯示出高度的一致性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GS環(huán)保脫蠟液可代替二甲苯應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變檢測,有利于實(shí)驗(yàn)人員的健康和環(huán)境保護(hù),是一種值得推廣、污染少的安全試劑。