汪曉丹,張 明,李 娟,翁文佳,高艷青

(1首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院皮膚科,北京 100069;*通訊作者,E-mail:gyqing2001bj@sina.com)

20世紀以來隨著HIV/AIDS的流行及其他危險因素的增多,如靜脈吸毒、男男性接觸(men who have sex with men,MSM),梅毒合并HIV的感染率越來越高。以色列一項研究[1]發(fā)現(xiàn)雖然抗病毒治療已推廣,但HIV在MSM者的感染率仍在攀升,相應的梅毒在MSM HIV感染者中的患病率也在升高。梅毒與HIV感染的免疫反應均較復雜,本研究嘗試從固有免疫細胞NK、DC著手,初步探索梅毒合并HIV感染的相互作用,為HIV合并梅毒患者的臨床診斷、治療提供進一步理論基礎。

1 材料與方法

1.1 研究對象

研究對象均來自2009-2014年首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院性病艾滋病診療中心隨訪的MSM隊列人群。其中26例早期梅毒患者(包括一期、二期梅毒、早期潛伏梅毒,且不伴HIV感染),18例HIV感染者(外周血CD4≥350個/μl,感染HIV時間>6個月),18例早期梅毒合并HIV患者(外周血CD4≥350個/μl,感染HIV時間>6個月)。收集病例過程中不包括年齡小于18歲、孕婦或合并有活動性肺結(jié)核的患者。所有梅毒患者均未進行驅(qū)梅治療,所有HIV感染者均未進行高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(highly active antiretro-viral therapy,HAART)治療。選擇MSM隊列中性別和年齡相匹配的未暴露于HIV和梅毒的20例健康者作為對照。四組入選得一般情況見表1。

表1 四組患者的基線資料

組別病例數(shù)年齡(歲)梅毒分期(例)基線RPR一期梅毒二期梅毒早期潛伏梅毒≤1∶41∶8-1∶32>1∶32CD4計數(shù)(個/μl)HIV載量(copies/ml)健康組2036(24-53)--------早期梅毒組2631(24-42)481411132--HIV組1829(19-44)------436(359-530)30920(1294-1157417)合并組1833(20-48)35103132410(351-623)45621(460-266000)

表中的數(shù)據(jù)為中位數(shù)(范圍),“-”為未做

1.2 方法

1.2.1 Ficoll-Hypaque密度離心法分離PBMC 健康對照組采集新鮮血。取新鮮采集的EDTA抗凝全血離心(TGL-16G臺式離心機,北京六一儀器廠)去除血漿后,用PBS稀釋一倍,加至淋巴細胞分離液上層,2 500 r/min,離心25 min,取中間白膜層(即單核細胞和淋巴細胞富集層),PBS洗滌2遍,得到外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。早期梅毒組、HIV感染組、早期梅毒合并HIV感染組均為凍存PBMC,于42 ℃恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司),快速晃動凍存管,使凍存的細胞在1 min內(nèi)解凍。

1.2.2 熒光抗體染色 利用熒光抗體染色,MutilTestCD 3FITC/CD16+CD56 PE/CD45 PerCP/CD19 APC(美國BD公司),CD3 PerCP,CD4 APC,CD123 PE,CD11C APC(美國eBioscience公司)。選擇CD3-CD16+CD56+來界定NK細胞,利用CD123 PE標記pDC,利用CD11c APC標記mDC。

1.2.3 流式細胞儀檢測 采用FACSCalibur型流式細胞儀(美國BD公司),分析早期梅毒組、HIV感染組、早期梅毒合并HIV感染組及健康組外周血中NK細胞、DC細胞數(shù)目。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 四組間NK細胞的比較

分析HIV感染者、早期梅毒患者、早期梅毒合并HIV感染者及健康人外周血中NK細胞，結(jié)果表明,合并組的NK細胞比率(13.82%±3.36%)比健康對照組(34.30%±4.25%)明顯降低(P<0.05),其余各組間比率均無明顯差異(見圖1)。

與健康組比較，*P<0.05圖1 NK細胞在四組人群中的比較 (*P<0.05)

2.2 四組間DC細胞的比較

分析HIV感染者、早期梅毒患者、早期梅毒合并HIV感染者及健康人外周血中DC兩個亞群mDC和pDC所占比率的差異，結(jié)果顯示，HIV感染組mDC比率(3.50%±0.47%)明顯低于早期梅毒組(12.47%±1.53%,P<0.001)、合并組(7.79%±0.48%,P<0.05)、健康組(5.36%±0.57%,P<0.05);早期梅毒組明顯高于健康組(P<0.05),其余組間比率均無明顯差異。pDC在四組間未發(fā)現(xiàn)差異(見圖2)。

與健康組比較，*P<0.05;與HIV組比較，#P<0.05,##P<0.001圖2 mDC和pDC在四組人群中的比較

3 討論

因為傳播途徑相似,梅毒和HIV感染相互促進。梅毒下疳或其他皮損局部的樹突狀細胞、自然殺傷細胞和T細胞有利于HIV全身播散[2]。此外,梅毒感染可使外周血HIV病毒載量升高,CD4數(shù)目下降,從而增加HIV傳播給其他性伴侶的概率[3]。梅毒免疫反應極其復雜,病理生理研究表明,梅毒不僅僅是由于毒性或炎癥物質(zhì)釋放造成的簡單急性炎癥反應,梅毒皮損中占主導地位的是單核巨噬細胞,而非急性炎癥的多核白細胞。目前認為梅毒的免疫是一種遲發(fā)型變態(tài)反應,它的效應T細胞產(chǎn)生的細胞因子在梅毒螺旋體的清除過程中起重要作用。然而,HIV作為一種免疫缺陷病毒,可引起細胞免疫嚴重受損,人們推測HIV感染或許可以改變機體針對梅毒螺旋體的感染免疫。研究發(fā)現(xiàn)在21.8%有梅毒癥狀的HIV梅毒共感染患者中觀察到皮膚外非典型臨床表現(xiàn),包括眼部、胃腸道等癥狀[4]。推測處于免疫缺陷狀態(tài)時,梅毒可能會加速進展,甚至出現(xiàn)所謂的“惡性梅毒”[5]固有免疫作為機體免疫的第一道防線,在疾病的發(fā)生和進展過程中起重要作用,我們分別檢測了HIV感染者、早期梅毒患者、早期梅毒合并HIV感染者及健康人的NK、DC細胞,以此初步探索梅毒合并HIV感染相互作用的特點。

3.1 NK細胞與梅毒

NK細胞是免疫系統(tǒng)的第一道防線,在適應性免疫啟動之前,就可發(fā)揮免疫效應。它可分泌細胞因子INF-γ、TNF-β等,通過NK-INF-γ-巨噬-IL-12這一固有免疫網(wǎng)絡,維持Th1在梅毒感染中的優(yōu)勢狀態(tài)[6]。NK細胞作用機制主要是通過激活凋亡酶系統(tǒng)以及表達抑制性受體來平衡其在機體中的免疫作用[7]。目前關于NK在梅毒患者的研究主要集中在功能和外周血的數(shù)量。多數(shù)研究認為梅毒患者NK細胞功能下降,即抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)及INF-γ、TNF-α分泌能力下降,且這種下降與梅毒病程遷延有關。但Jensen等[8]對25例早期梅毒患者,包括一期、二期和隱性梅毒患者治療前后分析發(fā)現(xiàn),NK細胞活性與梅毒分期有關:一期梅毒血清轉(zhuǎn)陽之前NK細胞功能升高,而在二期或隱性梅毒血清轉(zhuǎn)陽之后,NK細胞活性下降。并發(fā)現(xiàn)NK細胞活性下降與血清中的循環(huán)免疫復合物相關,通過阻滯與Fc受體的結(jié)合,減弱了NK細胞的ADCC作用。關于NK細胞在外周血的數(shù)量,國內(nèi)外研究研究較少,目前無較為一致的觀點。Cruz等[9]第一次發(fā)現(xiàn)梅毒患者外周血NK細胞總量下降,但無功能的CD56negativeCD16brightNK細胞卻升高。CD56negativeCD16brightNK細胞ADCC活性及INF-α、TNF-α分泌能力均較差,一般多在難以控制的病毒感染中升高。

3.2 NK細胞與HIV感染

在HIV感染中,關于NK細胞較為一致的結(jié)論為:NK細胞的功能如ADCC,細胞因子分泌下降,無功能性的NK細胞亞群即CD56negativeCD16brightNK異常升高,NK細胞的總量變化不大。Madhavi等[10]研究發(fā)現(xiàn)，HIV感染慢性期ADCC活性低的CD56negativeCD16brightNK細胞異常增多,并在抗病毒治療后恢復。推測這部分無功能性NK細胞可能與CD4恢復不良及免疫重建不良有關[11]。有研究認為NK細胞在組織的重新分布造成了其外周血數(shù)目的減少[12]。

本研究對早期梅毒組、HIV感染組、梅毒合并HIV感染組與健康對照組進行比較,發(fā)現(xiàn)合并組NK細胞明顯低于健康對照。而HIV感染組、早期梅毒組NK細胞均未發(fā)現(xiàn)明顯減少?；蛟S是由于合并HIV感染后,大量出現(xiàn)無功能的NK細胞亞群即CD56negativeCD16brightNK,所以外周血CD16+CD56+NK相應減少。

3.3 DC細胞與梅毒

DC是功能最強的專職性抗原提呈細胞,是聯(lián)接固有免疫與適應性免疫的“紐帶”,在梅毒感染中,DC另一個重要的作用是免疫調(diào)節(jié)功能。它的兩個亞群mDC和pDC可對不同抗原表達產(chǎn)生不同的細胞因子,mDC通過合成和分泌IL-12促進Th細胞向Th1分化;pDC不分泌IL-12,可使Th細胞向Th2分化。在梅毒“Th1向Th2漂移”現(xiàn)象中起調(diào)節(jié)作用。對四組樣本的比較發(fā)現(xiàn):早期梅毒患者外周血CD11c+mDC細胞高于正常人,而CD123+pDC細胞與正常人無顯著差異。提示梅毒螺旋體在機體內(nèi)促使DC向mDC分化,Th1反應增強,引起細胞免疫;而pDC無明顯增多,Th2型反應未見明顯增強,提示體液免疫在梅毒病程中的作用較弱。

3.4 DC細胞與HIV

DC在發(fā)揮早期免疫作用的同時,也是HIV感染的靶細胞和儲存場所。HIV感染后外周血和組織中的DC數(shù)量往往大幅減少,功能下降。CD123+的pDC為DC主要亞群,能分泌INF-γ,抑制HIV病毒復制,增強T細胞、單核細胞的功能,是固有免疫抗HIV感染的重要組成部分。DC在抑制與清除HIV的同時,也可能促進HIV病毒在體內(nèi)播散。DC細胞表面有CCR4、CCR5、CXCR4等受體,這些都是HIV侵入細胞的輔助受體。因此,DCs在HIV感染中的作用始終存在爭議。有學者對長期無進展者(long term nonprogressors,LTNPs)、正常進展的HIV感染者以及AIDS患者進行分析,發(fā)現(xiàn)LTNPs者pDC顯著升高,而AIDS顯著降低,且外周血的pDC數(shù)目與HIV病毒載量呈負相關,pDC數(shù)目減少與機會性感染有關[13,14]。但亦有學者報道HIV感染后DC的數(shù)量和功能未發(fā)生改變[15,16]。Zhang等[17]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過60周抗病毒治療(ART)后,典型慢性HIV感染者的mDC始終低于長期無進展者,推測mDC或可保護HIV感染者免于進展至AIDS。為了更好地描述其免疫狀態(tài),本研究選取CD4≥350個/μl,感染時間>6個月的典型慢性HIV感染者,結(jié)果發(fā)現(xiàn),HIV感染患者中mDC與其他三組相比均降低,而pDC無明顯變化，與Zhang等[17]研究結(jié)果一致。合并組mDC高于HIV感染組,或許與HIV患者感染早期梅毒后機體Th1反應增強,mDC相應升高,“中和”HIV感染對mDC的消耗有關。梅毒和HIV感染均以細胞免疫為主,故pDC介導的體液免疫在以上不同患者組間未發(fā)現(xiàn)差異。

本研究從固有免疫NK、DC細胞著手初步探索梅毒合并HIV感染相互作用的特點。發(fā)現(xiàn)梅毒合并HIV感染者在一定程度上增加了機體固有免疫系統(tǒng)的損耗,促進了梅毒的進展。但梅毒與HIV感染的免疫反應極為復雜,固有免疫僅為人體免疫的第一道防線,未來仍需要更多的研究來探索適應性免疫,以徹底闡明梅毒合并HIV感染的免疫狀態(tài)。