楊永能

（云南省楚雄彝族自治州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南楚雄 675000）

豬傳染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia，PCP）是世界范圍的豬病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為有效地預(yù)防和控制該病，建立一種快速、靈敏又特異的檢測(cè)方法勢(shì)在必行。目前，國(guó)內(nèi)診斷該病的方法大多是采用細(xì)菌分離鑒定和血清學(xué)診斷，細(xì)菌分離鑒定費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、過程繁瑣且有時(shí)分離不到致病菌；血清學(xué)診斷雖然簡(jiǎn)便、快速，但有其局限性，如亞臨床感染或帶菌狀態(tài)下易造成假陰性，對(duì)免疫豬和感染豬不能做出有效的鑒別診斷。豬傳染性胸膜肺炎有15個(gè)血清型，目前，雖然已建立了以胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP） APXI、APXII、APXIII及OMP等某一DNA片段為目標(biāo)基因的PCR診斷方法，但與胸膜肺炎放線桿菌相近的菌屬較多，且也存在這些目標(biāo)基因或者與目標(biāo)基因差別極小的基因片段，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，偶爾會(huì)出現(xiàn)假陽性，造成誤診。APXIVA基因與APXI、APXII、APXIII基因不同，APXI、APXII、APXIII等基因只存在于部分血清型的胸膜肺炎放線桿菌中，APXIVA則存在于所有血清型中。據(jù)報(bào)道，以放線桿菌所有的15個(gè)血清型菌株為模板，用PCR方法都能擴(kuò)增出APXIVA片段，而從其他親緣關(guān)系相近的細(xì)菌中無法擴(kuò)增出這一片段，說明該片段具有很高的種屬特異性。以APXIVA基因某一DNA片段為目標(biāo)基因建立PCR診斷方法，有利于疾病發(fā)生時(shí)的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查，具有廣闊的應(yīng)用前景和實(shí)用價(jià)值。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 菌株來源

標(biāo)準(zhǔn)菌株：傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清型2型和5型標(biāo)準(zhǔn)菌株和副豬嗜血桿菌菌株購自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所微生物菌種保藏中心。分離菌株和對(duì)照菌株（鏈球菌、巴氏桿菌、大腸桿菌）均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

高壓鍋、超凈臺(tái)、冰箱、恒溫培養(yǎng)箱、PCR儀、瓊脂糖凝膠電泳儀、瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)、移液槍、水浴鍋、離心管、顯微鏡、載玻片等由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心提供。

1.3 試驗(yàn)材料及試劑

還原型輔酶A、巧克力瓊脂培養(yǎng)基、PPLO瓊脂培養(yǎng)基、脲酶、觸酶、七葉苷、水楊苷、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、海藻糖等均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心提供。2×Trans HiFi MixⅡ、dNTP購自大連寶生物技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù) Nahuel和 Alain等[2，3]報(bào)告的 APXIVA 基因序列，針對(duì)目前主要流行的血清型設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性引物，并提交上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

2 試驗(yàn)步驟

2.1 DNA提取

分別取傳染性胸膜肺炎放線桿菌、鏈球菌、巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株菌液1.5 mL。于12 000 rpm離心1 min，棄上清，根據(jù)上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司細(xì)菌總DNA抽提試劑盒進(jìn)行細(xì)菌的DNA提取，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取情況，陽性DNA則于- 20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物序列

2.2 PCR體系及反應(yīng)條件優(yōu)化

利用提取的傳染性胸膜肺炎放線桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA作為模板，對(duì)PCR反應(yīng)體系及條件進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)多次試驗(yàn)摸索和優(yōu)化，最終確立最佳PCR反應(yīng)體系和條件分別為：

⑴第1輪PCR反應(yīng)（外鏈擴(kuò)增）體系及條件（擴(kuò)增條帶為442 bp）：

表2 第1輪PCR反應(yīng)的PCR擴(kuò)增體系

第1輪PCR反應(yīng)（外鏈）擴(kuò)增程序?yàn)椋孩?4℃預(yù)變性5 min，②94℃變性30 s，③52℃退火30 s，④72℃延伸30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，⑤72℃延伸5 min。

⑵ 第2輪PCR反應(yīng)（內(nèi)鏈）擴(kuò)增體系及條件（擴(kuò)增條帶為378 bp）：

表3 第2輪PCR反應(yīng)的PCR擴(kuò)增體系

第2輪PCR反應(yīng)（內(nèi)鏈）擴(kuò)增程序?yàn)椋孩?5℃預(yù)變性5 min，②94℃變性30 s，③52℃退火30 s，④72℃延伸30s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，⑤72℃延伸5 min。

取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與6×Loading Buffer混合均勻后加樣到1.5%瓊脂糖凝膠（含0.2%EB）孔中，并在100 V電壓下電泳40 min，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果，并拍照。

2.3 PCR特異性測(cè)定

分別用與呼吸道有關(guān)的病原菌（鏈球菌、巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌和大腸桿菌）作為模板，按上述相同方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，觀察電泳結(jié)果。

2.4 PCR靈敏性檢測(cè)

分別挑取傳染性胸膜肺炎放線桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株血清型2型和血清型5型接種于液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)24 h后；取0.2 mL菌液加1.8 mL PBS液混勻稀釋后作為第1管，從第1管中取0.2 mL菌液加1.8 mL PBS液混勻稀釋后作為第2管，從第2管中取0.2 mL菌液加1.8 mL PBS液混勻稀釋后作為第3管……依次往下（10倍稀釋）稀釋至第8管。分別從稀釋好的各管中取出1 mL，用上述所建的檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，觀察電泳結(jié)果。并用核酸定量?jī)x測(cè)定各管中菌液的濃度。

2.5 PCR檢測(cè)方法的實(shí)際應(yīng)用

對(duì)云南各地送檢的7份疑似傳染性胸膜肺炎感染的病料采用細(xì)菌分離生化鑒定方法及上述所建的PCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，比較所建的PCR檢測(cè)方法與細(xì)菌分離生化鑒定法的符合率。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 細(xì)菌DNA的提取

將放線桿菌血清型2型和5型標(biāo)準(zhǔn)菌株及放線桿菌地方流行毒株提取后的DNA進(jìn)行電泳檢測(cè)，確定已抽提出DNA。

3.2 第1輪 （外鏈擴(kuò)增）和第2輪 （內(nèi)鏈擴(kuò)增）PCR反應(yīng)的優(yōu)化

利用提取的傳染性胸膜肺炎放線桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和地方流行株DNA作模板，對(duì)PCR反應(yīng)體系及條件進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)多次試驗(yàn)和優(yōu)化，最終確立第1輪最佳PCR反應(yīng)并擴(kuò)增出442 bp條帶（圖1），第2輪最佳PCR反應(yīng)并擴(kuò)增出378 bp條帶（圖2）。

圖1 菌株第1輪PCR產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)果

圖2 菌株第2輪PCR產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)果

3.3 PCR特異性測(cè)定

以鏈球菌、巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌以及大腸桿菌的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，2對(duì)引物只能對(duì)傳染性胸膜肺炎放線桿菌擴(kuò)增出378 bp和442 bp的目的片段（見圖3）。

3.4 PCR靈敏性檢測(cè)

從稀釋好的菌液中取1 mL用上述所建的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，并測(cè)得原濃度（未稀釋）菌液濃度為4.8×108個(gè)/mL，且第1輪PCR檢出率為480個(gè)/mL（見圖4）；第2輪PCR最低檢出率為48個(gè)/mL（見圖5）。

圖3 參考菌株電泳鑒定結(jié)果

圖4 標(biāo)準(zhǔn)菌株第1輪PCR產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)果

3.5 PCR方法與經(jīng)典病原學(xué)方法對(duì)病料的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

對(duì)各養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的7份疑似傳染性胸膜肺炎感染的病料分別采用細(xì)菌分離生化鑒定和PCR檢測(cè)，結(jié)果均檢測(cè)出其中2份病料為傳染性胸膜肺炎放線桿菌陽性，其余均未檢測(cè)到傳染性胸膜肺炎放線桿菌（見圖6、圖7）。PCR檢測(cè)法與細(xì)菌分離生化鑒定檢測(cè)法的符合率為100%。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)菌株第2輪PCR產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)果

圖6 病料2電泳鑒定結(jié)果

圖7 病料6和7電泳鑒定結(jié)果

4 討論

建立的PCR檢測(cè)方法在送檢的7種病料中未檢測(cè)出鏈球菌、巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌和大腸桿菌等病原，利用此檢測(cè)方法能夠檢測(cè)到最低含量為48個(gè)/mL的細(xì)菌濃度。說明建立快速、靈敏、高通量的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌PCR診斷方法，可以為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的檢測(cè)提供一種確實(shí)有效的診斷方法。對(duì)采集的病料分離培養(yǎng)鑒定和病料提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后二者結(jié)果符合率為100%。