鎘脅迫對龍葵葉綠素?zé)晒夂凸夂仙匦缘挠绊?/h1>
2019-09-05 02:48:28唐星林金洪平劉光正王麗艷
中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報 2019年9期
唐星林，金洪平，周 晨，劉光正，王麗艷
（江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330000）
由于礦產(chǎn)資源的不合理開采、工業(yè)廢水的排放等原因，鎘（Cd）已成為土壤的主要污染物之一。土壤Cd可以被植物根系吸收并積累在植物體內(nèi)。當(dāng)植物體內(nèi)Cd濃度達(dá)到一定水平，Cd會對植物產(chǎn)生毒害作用[1]。Pahlsson等[2]發(fā)現(xiàn)植物葉片積累3～10 μg·g-1Cd就會對植物產(chǎn)生毒害。有研究表明：Cd過量積累會抑制植物根和莖的生長，導(dǎo)致葉片卷曲[3]，影響氮、鐵等營養(yǎng)元素的吸收[4]，產(chǎn)生氧化脅迫[5]，損害植物光合機(jī)構(gòu)，抑制光合作用，導(dǎo)致植株生物量下降[6]。Cd毒害可能通過不同機(jī)制來抑制葉片光合作用。有研究表明，Cd脅迫會抑制黃菖蒲[7]和烤煙[8]葉綠素的合成。Dalla等[9]發(fā)現(xiàn)Cd脅迫會破壞Elodea canadensis葉綠體類囊體膜結(jié)構(gòu)，抑制葉綠體的增殖。大量研究表明，Cd脅迫會導(dǎo)致植物葉片PSII最大光化學(xué)效率 （Fv/Fm）、PSII光化學(xué)效率（ΦPSII）、光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）和PSII的電子傳遞速率（J）等光合參數(shù)下降[8,10-11]，但也有研究表明Cd脅迫對葉片F(xiàn)v/Fm、ΦPSII和qP等參數(shù)無顯著影響[12-13]。Krantev等[14]發(fā)現(xiàn)Cd脅迫抑制玉米葉片核酮糖-二磷酸羧化酶（Rubisco酶）活性，這可能導(dǎo)致Rubisco酶最大羧化速率（Vcmax）下降[10]，進(jìn)而限制光合作用。有研究表明Cd脅迫會導(dǎo)致植物葉片氣孔密度[13]和氣孔大小[10]顯著降低，并導(dǎo)致氣孔開放數(shù)減少[15]，進(jìn)而引起氣孔導(dǎo)度（gs）下降。人們認(rèn)為氣孔限制、葉肉限制和光合生化限制是導(dǎo)致葉片光合作用下降的3個主要原因[16]。Tang等[13]發(fā)現(xiàn)Cd脅迫對滇苦菜光合作用的限制主要來自于氣孔限制和葉肉限制，而生化限制的作用較小。由于植物種類、Cd濃度和脅迫時間的差異，Cd脅迫對葉片光合生理生化特性的影響并不一致。
龍葵Solanum nigrum是一種Cd超積累植物，具有耐Cd毒害和富集Cd的能力，是實施植物修復(fù)的優(yōu)良材料。郭智等[17]發(fā)現(xiàn)Cd脅迫會抑制龍葵葉片光合作用，但Cd脅迫下龍葵光合生理響應(yīng)及其主要光合限速因子還不清楚。鑒于此，本研究通過研究Cd脅迫對龍葵葉綠素?zé)晒馓匦?、光合光響?yīng)和光合CO2響應(yīng)的影響，分析Cd脅迫對龍葵葉片光合生化特性的影響，明確Cd脅迫下龍葵光合作用的主要限制因子，深入了解Cd毒害的光合生化機(jī)制，旨在為超積累植物耐性機(jī)理研究提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料與處理
2018年3月12 號，選取飽滿的龍葵種子，10 g·L-1KNO3浸泡4 h，用超純水沖洗干凈，播種于盛放播種基質(zhì)的穴盤中，放置于江西省林業(yè)科學(xué)院科研大棚。待幼苗長出4片真葉后，用自來水將幼苗根系附著的基質(zhì)沖洗干凈，并進(jìn)行營養(yǎng)液栽培，每4 d更換一次營養(yǎng)液。營養(yǎng)液含 1.99 mmol·L-1K2SO4、4 mmol·L-1CaCl2、1.01 mmol·L-1KH2PO4、6.25 mmol·L-1NH4NO3、2 mmol·L-1MgSO4·7H2O、100.32 μmol·L-1H3BO3、131.95 μmol·L-1MnSO4·H2O、29.97 μmol·L-1ZnSO4·7H2O、5 μmol·L-1KI、0.1 μmol·L-1CuSO4·5H2O、0.11 μmol·L-1CoCl2·6H2O、1.03 μmol·L-1Na2MoO4·2H2O、100 μmol·L-1FeSO4·7H2O2、100.2 μmol·L-1EDTANa2。栽培30 d后進(jìn)行如下處理：對照（CK），不加任何藥品；鎘脅迫（Cd），添加40 μmol·L-1CdCl2。處理30 d后進(jìn)行實驗測定。
1.2 試驗方法
1.2.1 葉綠素相對含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定
葉片葉綠素相對含量采用SPAD-502 葉綠素儀測定，每株植物隨機(jī)選取生長旺盛的葉片8片，測定其葉綠素值，取平均值。植物葉片進(jìn)行暗處理30 min后，采用便攜式脈沖調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x（FluorPen FP 100，Czech Republic）測定初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）、Fv/Fm、qP和非光化學(xué)淬滅系數(shù)（NPQ）。每個處理重復(fù)測定5株。
1.2.2 光響應(yīng)曲線和CO2響應(yīng)曲線的測定
采用美國LiCor公司的便攜式光合作用儀（Li-6400XT）進(jìn)行測量。實驗均在晴天進(jìn)行，時間段為9:00 —16:30。植物葉片先在近飽和光合有效輻射（PAR）1 200 μmol·m-2s-1、樣本室CO2濃度400 μmol·mol-1、溫度為（26±2）℃、空氣相對濕度60% ～ 70%條件下，誘導(dǎo)30 min以上，直到光合速率和氣孔導(dǎo)度相對穩(wěn)定，采用儀器內(nèi)置自動測量系統(tǒng)把PAR設(shè)定為1 200、1 000、800、600、400、300、200、150、100、50、20、0 μmol·m-2s-1，測定凈光合速率數(shù)據(jù)，每個PAR下平衡時間為2 ～ 3 min。每個處理重復(fù)測定5片葉。植物葉片在PAR1 200 μmol·m-2s-1、參比室CO2濃度400 μmol·mol-1、溫度（26±2）℃、空氣相對濕度60% ～ 70%條件下，誘導(dǎo)30 min以上，直到光合速率和氣孔導(dǎo)度相對穩(wěn)定，利用Li-6400-01液化鋼瓶控制參比室中的CO2濃度依次為400、300、200、100、50、450、600、800、1 000、1 200 μmol·mol-1并測定凈光合速率。每種植物重復(fù)測量5片葉。
1.2.3 植株生物量和比葉重的測定
CO2響應(yīng)曲線測定結(jié)束后立即采集葉片并測定其比葉重。植物收獲后，將其分為根、莖和葉3部分。根系用去離子水沖洗干凈。植物樣品經(jīng)105 ℃殺青30 min，70 ℃下烘至恒質(zhì)量，并測定其生物量。
1.2.4 數(shù)據(jù)分析
采用直角雙曲線修正模型[18]擬合光響應(yīng)曲線，獲得最大凈光合速率（Amax）、表觀量子效率（AQY）、光補(bǔ)償點(diǎn)（LCP）、飽和光強(qiáng)（LSP）和光下暗呼吸速率（Rd）等光合光響應(yīng)參數(shù)。直角雙曲線修正模型的描述如下：
式中：α為初始量子效率；β、γ為模型系數(shù)。
令A(yù)=0，計算LCP。LSP為：
Amax為：
采用FvCB光合模型擬合CO2響應(yīng)曲線，獲得Vcmax、Jmax、Rubico酶活性限制階段與RuBP再生速率限制階段的臨界胞間CO2濃度（Ci_CJ）等光合生化參數(shù)。Rd采用光響應(yīng)曲線的擬合值作為輸入值，擬合算法參考Gu等[19]的方法。FvCB光合模型表達(dá)式為：
式中：A為凈光合速率；Ac為Rubisco酶活性限制階段的凈光合速率；Aj為RuBP再生速率限制階段的凈光合速率。
當(dāng)光合作用受Rubisco酶活性限制時，凈光合速率（Ac）為：
式中：Kc為RuBP酶羧化反應(yīng)米氏常數(shù)（27.238 Pa）；Ko為RuBP酶氧化反應(yīng)米氏常數(shù)（16 582 Pa）；Ci為胞間CO2濃度；Γ*為缺乏暗呼吸的葉綠體CO2補(bǔ)償點(diǎn)（3.743 Pa）；O為氧氣濃度（21 220 Pa）；Rd為光下暗呼吸速率。
當(dāng)光合作用RuBP再生速率限制時，凈光合速率（Aj）為：
式中：J為PSII電子傳遞速率；J與Jmax的關(guān)系常用經(jīng)驗公式進(jìn)行描述[14]。
式中：θ為非直角雙曲線函數(shù)曲率（經(jīng)驗值為1）；I2為PSII吸收的有效光輻射。
式中：PAR為光合有效輻射；α1為葉片的光吸收系數(shù)（經(jīng)驗值為0.85）；fⅡ為光能在光系統(tǒng)I（PSI）和光系統(tǒng)II（PSⅡ）中分配的比例（經(jīng)驗值為0.5）；ΦPSIImax為最大PSII光化學(xué)效率（經(jīng)驗值為1）。
從CO2響應(yīng)曲線中獲取1 200 μmol·mol-1CO2下的凈光合速率（A）、CO2氣孔導(dǎo)度（gsc）和胞間CO2濃度（Ci）等光合參數(shù)進(jìn)行分析。在1 200 μmol·mol-1CO2濃度下龍葵葉片光合作用受RuBP再生速率限制，參考Wilson的方法[20]，利用A、gsc和Jmax參數(shù)來量化氣孔限制（Stomatal limitation，SL）和非氣孔限制（Nonstomatal limitation,NSL）的大小。本研究以對照組的光合參數(shù)作為最大參考值來進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行如下分析：采用Dixon法去除異常值，進(jìn)行Kolmogrov-Smirnov正態(tài)性檢驗，采用獨(dú)立樣本t檢驗對獲得的參數(shù)進(jìn)行大小比較（P＜0.05）；對于不服從正態(tài)分布或方差非齊性的參數(shù)，采用wilcoxon秩和檢驗進(jìn)行大小比較（P＜0.05）。對于服從正態(tài)分布的參數(shù)，進(jìn)行Pearson積矩相關(guān)分析；不服從正態(tài)分布的參數(shù)，進(jìn)行Spearman秩相關(guān)分析。利用Microsoft Excel 2016和R語言（R-3.5.1）進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、分析和作圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 鎘脅迫對龍葵葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響
研究結(jié)果表明，F(xiàn)o不服從正態(tài)分布，F(xiàn)v/Fm方差表現(xiàn)為非齊性，采用wilcoxon秩和檢驗進(jìn)行大小比較。qP、NPQ和SPAD值均服從正態(tài)分布且方差表現(xiàn)為齊性，采用獨(dú)立樣本t檢驗進(jìn)行大小比較。由表1可知，Cd處理下龍葵的Fo顯著大于CK（增大了42.7%；P＜0.05），F(xiàn)v/Fm顯著小于CK；Cd脅迫下的SPAD值顯著小于CK（減小了22.9%；P＜0.05）；不同處理下，龍葵葉片qP和NPQ均無顯著差異（P＞0.05）。
表1 鎘脅迫對龍葵SPAD值和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響 (平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差）Table 1 Effects of Cd stress on SPAD and chlorophyll a fluorescence parameters of Solanum nigrum (mean±SE)
2.2 鎘脅迫對龍葵光合-光響應(yīng)的影響
在CK和Cd脅迫下，龍葵光合光響應(yīng)變化呈現(xiàn)出相似規(guī)律（圖1）。龍葵的A均隨PAR的增大而逐漸增加，最后趨于平緩，達(dá)到飽和。當(dāng)PAR≤ 200 μmol·m-2s-1時，凈光合速率幾乎呈線性增加，而且CK的凈光合速率增幅明顯高于Cd處理，這說明龍葵光合作用對PAR的變化非常敏感，而且Cd的敏感程度較CK的低。當(dāng)PAR為200～800 μmol·m-2s-1時，A的增加變得趨緩。當(dāng)PAR為800～1 200 μmol·m-2s-1時，A趨于平緩，達(dá)到飽和。
研究結(jié)果表明，所有光響應(yīng)參數(shù)均服從正態(tài)分布。LCP方差表現(xiàn)為非齊性，AQY、Amax和Rd方差表現(xiàn)為齊性。部分光響應(yīng)曲線擬合獲得的LSP遠(yuǎn)超出閾值，故未對其進(jìn)行分析。與CK相比，Cd脅迫下龍葵葉片Amax減小了24.9%（P＜0.05，表1）。不同處理間龍葵葉片AQY無顯著差異。Cd脅迫下龍葵葉片LCP小于CK（差異不顯著，P＞0.05）。Cd脅迫下龍葵葉片Rd顯著大于CK（P＜0.05）。
圖1 鎘脅迫下龍葵葉片的光響應(yīng)曲線(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)Fig.1 Light response curves of net photosynthetic rate (A) in Solanum nigrum under Cd stress (mean±SE)
表2 鎘脅迫對龍葵光響應(yīng)參數(shù)的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)Table 2 Effects of Cd stress on photosynthesis-light response parameters of Solanum nigrum (mean±SE)
圖2 鎘脅迫下龍葵葉片CO2響應(yīng)曲線Fig.2 CO2 response curves of net photosynthetic rate (A) in Solanum nigrum under Cd stress
2.3 鎘脅迫對龍葵光合-CO2響應(yīng)的影響
在CK和Cd脅迫下，龍葵的A均隨Ci的增大而逐漸增加，最后趨于平緩（圖2）。當(dāng)Ci≤Ci_CJ時，A隨Ci的增大幾乎呈線性增加，這說明龍葵光合作用受Rubisco酶活性大小的限制 （實線）；而且，CK的A增幅明顯高于Cd處理，說明Cd脅迫下A對Ci變化的敏感程度較CK的低。當(dāng)Ci≥Ci_CJ時，A的增加變得趨緩，說明光合作用受RuBP再生速率大小的限制 （虛線）。采用可決系數(shù) （R2）對FvCB模型的擬合效果進(jìn)行分析，CK和Cd脅迫CO2響應(yīng)曲線擬合的R2為0.956 7 ～ 0.991 1。
表3中光合參數(shù)均服從正態(tài)分布。方差齊性檢驗結(jié)果表明，Ci和Ci_CJ方差表現(xiàn)為非齊性，其它參數(shù)的方差表現(xiàn)為齊性。由表3可知，Cd脅迫下龍葵葉片的A、gsc、Ci、Vcmax和Jmax均顯著小于CK（P＜0.05），減小百分比分別為18.3%、51.2%、4.6%、34.1%和18%。Cd脅迫下的Ci_CJ顯著大于CK （增大百分比為46.9%；P＜0.05）。光合限制組分量化分析結(jié)果（表4）顯示，在Cd脅迫下龍葵葉片光合限速因子中，氣孔限制（SL）為17.86%，非氣孔限制（NSL）為82.14%。
表3 鎘脅迫對龍葵葉片光合參數(shù)的影響Table 3 Effects of Cd stress on photosynthetic parameters of Solanum nigrum (mean±SE)
表4 鎘脅迫下龍葵氣孔限制和非氣孔限制的比例Table 4 Photosynthesis limitation parameters in Solanum nigrum grown under Cd stress
2.4 鎘脅迫對龍葵生物量的影響
分析結(jié)果表明，不同處理下龍葵的生物量和SLW均服從正態(tài)分布且方差表現(xiàn)為齊性。由表5可知，鎘脅迫下龍葵單株生物量、地上部分生物量、根系生物量均顯著小于CK（P＜0.05），分別減小了46.8%、33.3%和49%。Cd脅迫對龍葵葉片SLW沒有顯著影響。Cd脅迫下龍葵根系/地上部分比例顯著高于CK（高31.5%；P＜0.05）。
分析結(jié)果表明，不同處理SPAD值與A不服從正態(tài)分布，采用Spearman秩相關(guān)分析；其余參數(shù)均服從正態(tài)分布，采用Pearson積矩相關(guān)分析。由表6可知，鎘脅迫下龍葵單株生物量、地上部分生物量與SPAD值、A、Amax、Vcmax、Jmax呈顯著相關(guān)關(guān)系。鎘脅迫下根系生物量與SPAD值、Amax、Vcmax、Jmax呈顯著相關(guān)關(guān)系。
表5 鎘脅迫對龍葵生物量和比葉重的影響Table 5 Effects of Cd stress on biomass and specific leaf weight of Solanum nigrum (mean±SE)
表6 鎘脅迫下龍葵生物量與光合參數(shù)的相關(guān)性分析?Table 6 Correlations between biomass and photosynthetic parameters of Solanum nigrum under Cd stress
由表7可知，龍葵葉片Amax與SPAD、Jmax、Vcmax、Rd呈顯著相關(guān)關(guān)系，A與SPAD、gsc顯著相關(guān)，SPAD與Jmax、Vcmax、gsc、Rd呈顯著相關(guān)關(guān)系，Vcmax與Jmax、gsc、Rd呈顯著相關(guān)關(guān)系，Jmax與gsc、Rd顯著相關(guān)。
3 結(jié)論與討論
光合作用是植物重要的生理過程。本研究表明，龍葵葉片光合速率（Amax和A）與生物量呈顯著相關(guān)關(guān)系，這說明光合作用于植株生物量累積密切相關(guān)。研究結(jié)果表明，Cd脅迫導(dǎo)致龍葵葉片最大凈光合速率（Amax）顯著下降，說明Cd脅迫導(dǎo)致龍葵葉片光合能力降低，這與Cd脅迫下垂柳[21]和烤煙[8]等的研究結(jié)果類似。大量研究表明，重金屬脅迫下光合速率的降低可能與光能的吸收、能量轉(zhuǎn)化、電子傳遞、Rubisco酶羧化反應(yīng)和葉片內(nèi)CO2擴(kuò)散等光合過程有關(guān)[8,10,16]。龍葵葉片Amax與SPAD、Jmax、Vcmax和Rd等參數(shù)顯著相關(guān)，說明龍葵光合作用的變化與葉綠素含量、光合電子傳遞、Rubisco羧化反應(yīng)、呼吸作用等密切相關(guān)。葉綠素是光合光反應(yīng)中的重要色素，可以反映葉片對光能的吸收和轉(zhuǎn)化能力。Cd脅迫下龍葵葉片的SPAD值顯著降低，表明其葉綠素含量下降，說明Cd脅迫可能抑制了龍葵葉片光合色素的合成，這與玉米[22]、美洲黑楊[10]的研究結(jié)果類似。這還可能與Cd脅迫下葉綠體數(shù)量的減少[23]、礦質(zhì)元素吸收受阻[24]有關(guān)。Cd脅迫下葉綠素含量的下降會直接導(dǎo)致龍葵葉片對光能的吸收和利用能力降低。Cd脅迫下龍葵葉片Rd顯著增大，說明葉片可能通過增加呼吸作用以獲得更多的能量來應(yīng)對鎘毒害，這與Cd脅迫下玉米[24]的研究結(jié)果類似。本研究發(fā)現(xiàn)Cd脅迫下龍葵葉片gsc和Ci減小，說明葉片氣孔阻力增大，這可能與Cd脅迫下氣孔密度和開放氣孔數(shù)的減少有關(guān)[13]。本研究還發(fā)現(xiàn)Cd脅迫導(dǎo)致龍葵葉片Vcmax和Jmax降低，這說明Cd毒害對葉片Rubisco酶羧化反應(yīng)和電子傳遞過程有一定的抑制作用，這與美洲黑楊[10]的研究結(jié)果類似。Vcmax的降低可能是由Cd脅迫下Rubisco酶活性的降低[14]和Rubisco酶基因表達(dá)水平的下降[25]而引起的。光合限制組分分析結(jié)果表明Cd脅迫下光合速率的限制主要來自于非氣孔限制（82.14%），這說明擴(kuò)散限制與生化限制的作用較大，這與滇苦菜[13]的研究結(jié)果類似。
表7 鎘脅迫下龍葵光合參數(shù)間相關(guān)性分析Table 7 Correlations between different photosynthetic parameters of Solanum nigrum under Cd stress
葉綠素?zé)晒鈪?shù)可以反映重金屬對光合機(jī)構(gòu)的脅迫程度。Fo可以反映PSII受到的損害程度。Fv/Fm為PSII最大光能轉(zhuǎn)化效率，反映葉片的光能轉(zhuǎn)化效率。研究結(jié)果表明，Cd脅迫下，龍葵葉片F(xiàn)o顯著增大，而Fv/Fm顯著下降，說明Cd脅迫導(dǎo)致龍葵葉片PSII受到損傷而降低了對光能的捕獲效率，這與Cd脅迫下滇潤楠[26]、烤煙[8]和美洲黑楊[10]等植物的研究結(jié)果類似。qP可以反映葉片吸收的光能，用于光合CO2固定和光呼吸等光化學(xué)過程的能量。NPQ則是反映不被用于光化學(xué)反映，而以熱能的形式釋放的能量，能防止過剩光能對光合機(jī)構(gòu)的傷害。本研究表明，Cd脅迫下龍葵葉片qP、NPQ與對照均無顯著差異，說明Cd脅迫對龍葵葉片吸收光能的分配機(jī)制沒有影響，這與大麥、玉米[12]和滇苦菜[13]等植物的研究結(jié)果類似。另一方面，LCP可以反映植物葉片對弱光的利用能力，AQY反映了葉片在弱光環(huán)境下的光合能力。惠俊愛等[27]發(fā)現(xiàn)Cd脅迫導(dǎo)致玉米葉片LCP升高、AQY降低，但本研究表明Cd脅迫對龍葵葉片LCP和AQY沒有顯著影響，這說明Cd脅迫下龍葵葉片對弱光的利用能力沒有改變。
重金屬脅迫對植物光合作用的限制可能與Rubisco酶含量及活性[14]、細(xì)胞色素f（cyt f）、ATP合酶等生理指標(biāo)有關(guān)。另一方面，重金屬脅迫下植物光合作用的變化還可能與氣孔大小及密度[16]、單位面積葉肉細(xì)胞暴露在胞間的面積和單位面積葉綠體暴露在胞間的面積等結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[28]有關(guān)。本研究僅從葉綠素?zé)晒夂凸夂仙匦苑矫鎭硌芯緾d脅迫對龍葵光合作用的影響，未能從生理特性和葉片結(jié)構(gòu)特點(diǎn)等多個方面來闡釋植物Cd污染的光合生理機(jī)制，未來擬結(jié)合生理指標(biāo)測定、光合生化模型模擬和葉片顯微結(jié)構(gòu)觀察等手段來研究Cd脅迫對植物光合作用的影響，以全面揭示Cd脅迫對植物光合作用的限制機(jī)理。
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唐星林，金洪平，周 晨，劉光正，王麗艷
（江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330000）
由于礦產(chǎn)資源的不合理開采、工業(yè)廢水的排放等原因，鎘（Cd）已成為土壤的主要污染物之一。土壤Cd可以被植物根系吸收并積累在植物體內(nèi)。當(dāng)植物體內(nèi)Cd濃度達(dá)到一定水平，Cd會對植物產(chǎn)生毒害作用[1]。Pahlsson等[2]發(fā)現(xiàn)植物葉片積累3～10 μg·g-1Cd就會對植物產(chǎn)生毒害。有研究表明：Cd過量積累會抑制植物根和莖的生長，導(dǎo)致葉片卷曲[3]，影響氮、鐵等營養(yǎng)元素的吸收[4]，產(chǎn)生氧化脅迫[5]，損害植物光合機(jī)構(gòu)，抑制光合作用，導(dǎo)致植株生物量下降[6]。Cd毒害可能通過不同機(jī)制來抑制葉片光合作用。有研究表明，Cd脅迫會抑制黃菖蒲[7]和烤煙[8]葉綠素的合成。Dalla等[9]發(fā)現(xiàn)Cd脅迫會破壞Elodea canadensis葉綠體類囊體膜結(jié)構(gòu)，抑制葉綠體的增殖。大量研究表明，Cd脅迫會導(dǎo)致植物葉片PSII最大光化學(xué)效率 （Fv/Fm）、PSII光化學(xué)效率（ΦPSII）、光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）和PSII的電子傳遞速率（J）等光合參數(shù)下降[8,10-11]，但也有研究表明Cd脅迫對葉片F(xiàn)v/Fm、ΦPSII和qP等參數(shù)無顯著影響[12-13]。Krantev等[14]發(fā)現(xiàn)Cd脅迫抑制玉米葉片核酮糖-二磷酸羧化酶（Rubisco酶）活性，這可能導(dǎo)致Rubisco酶最大羧化速率（Vcmax）下降[10]，進(jìn)而限制光合作用。有研究表明Cd脅迫會導(dǎo)致植物葉片氣孔密度[13]和氣孔大小[10]顯著降低，并導(dǎo)致氣孔開放數(shù)減少[15]，進(jìn)而引起氣孔導(dǎo)度（gs）下降。人們認(rèn)為氣孔限制、葉肉限制和光合生化限制是導(dǎo)致葉片光合作用下降的3個主要原因[16]。Tang等[13]發(fā)現(xiàn)Cd脅迫對滇苦菜光合作用的限制主要來自于氣孔限制和葉肉限制，而生化限制的作用較小。由于植物種類、Cd濃度和脅迫時間的差異，Cd脅迫對葉片光合生理生化特性的影響并不一致。
龍葵Solanum nigrum是一種Cd超積累植物，具有耐Cd毒害和富集Cd的能力，是實施植物修復(fù)的優(yōu)良材料。郭智等[17]發(fā)現(xiàn)Cd脅迫會抑制龍葵葉片光合作用，但Cd脅迫下龍葵光合生理響應(yīng)及其主要光合限速因子還不清楚。鑒于此，本研究通過研究Cd脅迫對龍葵葉綠素?zé)晒馓匦?、光合光響?yīng)和光合CO2響應(yīng)的影響，分析Cd脅迫對龍葵葉片光合生化特性的影響，明確Cd脅迫下龍葵光合作用的主要限制因子，深入了解Cd毒害的光合生化機(jī)制，旨在為超積累植物耐性機(jī)理研究提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料與處理
2018年3月12 號，選取飽滿的龍葵種子，10 g·L-1KNO3浸泡4 h，用超純水沖洗干凈，播種于盛放播種基質(zhì)的穴盤中，放置于江西省林業(yè)科學(xué)院科研大棚。待幼苗長出4片真葉后，用自來水將幼苗根系附著的基質(zhì)沖洗干凈，并進(jìn)行營養(yǎng)液栽培，每4 d更換一次營養(yǎng)液。營養(yǎng)液含 1.99 mmol·L-1K2SO4、4 mmol·L-1CaCl2、1.01 mmol·L-1KH2PO4、6.25 mmol·L-1NH4NO3、2 mmol·L-1MgSO4·7H2O、100.32 μmol·L-1H3BO3、131.95 μmol·L-1MnSO4·H2O、29.97 μmol·L-1ZnSO4·7H2O、5 μmol·L-1KI、0.1 μmol·L-1CuSO4·5H2O、0.11 μmol·L-1CoCl2·6H2O、1.03 μmol·L-1Na2MoO4·2H2O、100 μmol·L-1FeSO4·7H2O2、100.2 μmol·L-1EDTANa2。栽培30 d后進(jìn)行如下處理：對照（CK），不加任何藥品；鎘脅迫（Cd），添加40 μmol·L-1CdCl2。處理30 d后進(jìn)行實驗測定。
1.2 試驗方法
1.2.1 葉綠素相對含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定
葉片葉綠素相對含量采用SPAD-502 葉綠素儀測定，每株植物隨機(jī)選取生長旺盛的葉片8片，測定其葉綠素值，取平均值。植物葉片進(jìn)行暗處理30 min后，采用便攜式脈沖調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x（FluorPen FP 100，Czech Republic）測定初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）、Fv/Fm、qP和非光化學(xué)淬滅系數(shù)（NPQ）。每個處理重復(fù)測定5株。
1.2.2 光響應(yīng)曲線和CO2響應(yīng)曲線的測定
采用美國LiCor公司的便攜式光合作用儀（Li-6400XT）進(jìn)行測量。實驗均在晴天進(jìn)行，時間段為9:00 —16:30。植物葉片先在近飽和光合有效輻射（PAR）1 200 μmol·m-2s-1、樣本室CO2濃度400 μmol·mol-1、溫度為（26±2）℃、空氣相對濕度60% ～ 70%條件下，誘導(dǎo)30 min以上，直到光合速率和氣孔導(dǎo)度相對穩(wěn)定，采用儀器內(nèi)置自動測量系統(tǒng)把PAR設(shè)定為1 200、1 000、800、600、400、300、200、150、100、50、20、0 μmol·m-2s-1，測定凈光合速率數(shù)據(jù)，每個PAR下平衡時間為2 ～ 3 min。每個處理重復(fù)測定5片葉。植物葉片在PAR1 200 μmol·m-2s-1、參比室CO2濃度400 μmol·mol-1、溫度（26±2）℃、空氣相對濕度60% ～ 70%條件下，誘導(dǎo)30 min以上，直到光合速率和氣孔導(dǎo)度相對穩(wěn)定，利用Li-6400-01液化鋼瓶控制參比室中的CO2濃度依次為400、300、200、100、50、450、600、800、1 000、1 200 μmol·mol-1并測定凈光合速率。每種植物重復(fù)測量5片葉。
1.2.3 植株生物量和比葉重的測定
CO2響應(yīng)曲線測定結(jié)束后立即采集葉片并測定其比葉重。植物收獲后，將其分為根、莖和葉3部分。根系用去離子水沖洗干凈。植物樣品經(jīng)105 ℃殺青30 min，70 ℃下烘至恒質(zhì)量，并測定其生物量。
1.2.4 數(shù)據(jù)分析
采用直角雙曲線修正模型[18]擬合光響應(yīng)曲線，獲得最大凈光合速率（Amax）、表觀量子效率（AQY）、光補(bǔ)償點(diǎn)（LCP）、飽和光強(qiáng)（LSP）和光下暗呼吸速率（Rd）等光合光響應(yīng)參數(shù)。直角雙曲線修正模型的描述如下：
式中：α為初始量子效率；β、γ為模型系數(shù)。
令A(yù)=0，計算LCP。LSP為：
Amax為：
采用FvCB光合模型擬合CO2響應(yīng)曲線，獲得Vcmax、Jmax、Rubico酶活性限制階段與RuBP再生速率限制階段的臨界胞間CO2濃度（Ci_CJ）等光合生化參數(shù)。Rd采用光響應(yīng)曲線的擬合值作為輸入值，擬合算法參考Gu等[19]的方法。FvCB光合模型表達(dá)式為：
式中：A為凈光合速率；Ac為Rubisco酶活性限制階段的凈光合速率；Aj為RuBP再生速率限制階段的凈光合速率。
當(dāng)光合作用受Rubisco酶活性限制時，凈光合速率（Ac）為：
式中：Kc為RuBP酶羧化反應(yīng)米氏常數(shù)（27.238 Pa）；Ko為RuBP酶氧化反應(yīng)米氏常數(shù)（16 582 Pa）；Ci為胞間CO2濃度；Γ*為缺乏暗呼吸的葉綠體CO2補(bǔ)償點(diǎn)（3.743 Pa）；O為氧氣濃度（21 220 Pa）；Rd為光下暗呼吸速率。
當(dāng)光合作用RuBP再生速率限制時，凈光合速率（Aj）為：
式中：J為PSII電子傳遞速率；J與Jmax的關(guān)系常用經(jīng)驗公式進(jìn)行描述[14]。
式中：θ為非直角雙曲線函數(shù)曲率（經(jīng)驗值為1）；I2為PSII吸收的有效光輻射。
式中：PAR為光合有效輻射；α1為葉片的光吸收系數(shù)（經(jīng)驗值為0.85）；fⅡ為光能在光系統(tǒng)I（PSI）和光系統(tǒng)II（PSⅡ）中分配的比例（經(jīng)驗值為0.5）；ΦPSIImax為最大PSII光化學(xué)效率（經(jīng)驗值為1）。
從CO2響應(yīng)曲線中獲取1 200 μmol·mol-1CO2下的凈光合速率（A）、CO2氣孔導(dǎo)度（gsc）和胞間CO2濃度（Ci）等光合參數(shù)進(jìn)行分析。在1 200 μmol·mol-1CO2濃度下龍葵葉片光合作用受RuBP再生速率限制，參考Wilson的方法[20]，利用A、gsc和Jmax參數(shù)來量化氣孔限制（Stomatal limitation，SL）和非氣孔限制（Nonstomatal limitation,NSL）的大小。本研究以對照組的光合參數(shù)作為最大參考值來進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行如下分析：采用Dixon法去除異常值，進(jìn)行Kolmogrov-Smirnov正態(tài)性檢驗，采用獨(dú)立樣本t檢驗對獲得的參數(shù)進(jìn)行大小比較（P＜0.05）；對于不服從正態(tài)分布或方差非齊性的參數(shù)，采用wilcoxon秩和檢驗進(jìn)行大小比較（P＜0.05）。對于服從正態(tài)分布的參數(shù)，進(jìn)行Pearson積矩相關(guān)分析；不服從正態(tài)分布的參數(shù)，進(jìn)行Spearman秩相關(guān)分析。利用Microsoft Excel 2016和R語言（R-3.5.1）進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、分析和作圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 鎘脅迫對龍葵葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響
研究結(jié)果表明，F(xiàn)o不服從正態(tài)分布，F(xiàn)v/Fm方差表現(xiàn)為非齊性，采用wilcoxon秩和檢驗進(jìn)行大小比較。qP、NPQ和SPAD值均服從正態(tài)分布且方差表現(xiàn)為齊性，采用獨(dú)立樣本t檢驗進(jìn)行大小比較。由表1可知，Cd處理下龍葵的Fo顯著大于CK（增大了42.7%；P＜0.05），F(xiàn)v/Fm顯著小于CK；Cd脅迫下的SPAD值顯著小于CK（減小了22.9%；P＜0.05）；不同處理下，龍葵葉片qP和NPQ均無顯著差異（P＞0.05）。
表1 鎘脅迫對龍葵SPAD值和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響 (平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差）Table 1 Effects of Cd stress on SPAD and chlorophyll a fluorescence parameters of Solanum nigrum (mean±SE)
2.2 鎘脅迫對龍葵光合-光響應(yīng)的影響
在CK和Cd脅迫下，龍葵光合光響應(yīng)變化呈現(xiàn)出相似規(guī)律（圖1）。龍葵的A均隨PAR的增大而逐漸增加，最后趨于平緩，達(dá)到飽和。當(dāng)PAR≤ 200 μmol·m-2s-1時，凈光合速率幾乎呈線性增加，而且CK的凈光合速率增幅明顯高于Cd處理，這說明龍葵光合作用對PAR的變化非常敏感，而且Cd的敏感程度較CK的低。當(dāng)PAR為200～800 μmol·m-2s-1時，A的增加變得趨緩。當(dāng)PAR為800～1 200 μmol·m-2s-1時，A趨于平緩，達(dá)到飽和。
研究結(jié)果表明，所有光響應(yīng)參數(shù)均服從正態(tài)分布。LCP方差表現(xiàn)為非齊性，AQY、Amax和Rd方差表現(xiàn)為齊性。部分光響應(yīng)曲線擬合獲得的LSP遠(yuǎn)超出閾值，故未對其進(jìn)行分析。與CK相比，Cd脅迫下龍葵葉片Amax減小了24.9%（P＜0.05，表1）。不同處理間龍葵葉片AQY無顯著差異。Cd脅迫下龍葵葉片LCP小于CK（差異不顯著，P＞0.05）。Cd脅迫下龍葵葉片Rd顯著大于CK（P＜0.05）。
圖1 鎘脅迫下龍葵葉片的光響應(yīng)曲線(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)Fig.1 Light response curves of net photosynthetic rate (A) in Solanum nigrum under Cd stress (mean±SE)
表2 鎘脅迫對龍葵光響應(yīng)參數(shù)的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)Table 2 Effects of Cd stress on photosynthesis-light response parameters of Solanum nigrum (mean±SE)
圖2 鎘脅迫下龍葵葉片CO2響應(yīng)曲線Fig.2 CO2 response curves of net photosynthetic rate (A) in Solanum nigrum under Cd stress
2.3 鎘脅迫對龍葵光合-CO2響應(yīng)的影響
在CK和Cd脅迫下，龍葵的A均隨Ci的增大而逐漸增加，最后趨于平緩（圖2）。當(dāng)Ci≤Ci_CJ時，A隨Ci的增大幾乎呈線性增加，這說明龍葵光合作用受Rubisco酶活性大小的限制 （實線）；而且，CK的A增幅明顯高于Cd處理，說明Cd脅迫下A對Ci變化的敏感程度較CK的低。當(dāng)Ci≥Ci_CJ時，A的增加變得趨緩，說明光合作用受RuBP再生速率大小的限制 （虛線）。采用可決系數(shù) （R2）對FvCB模型的擬合效果進(jìn)行分析，CK和Cd脅迫CO2響應(yīng)曲線擬合的R2為0.956 7 ～ 0.991 1。
表3中光合參數(shù)均服從正態(tài)分布。方差齊性檢驗結(jié)果表明，Ci和Ci_CJ方差表現(xiàn)為非齊性，其它參數(shù)的方差表現(xiàn)為齊性。由表3可知，Cd脅迫下龍葵葉片的A、gsc、Ci、Vcmax和Jmax均顯著小于CK（P＜0.05），減小百分比分別為18.3%、51.2%、4.6%、34.1%和18%。Cd脅迫下的Ci_CJ顯著大于CK （增大百分比為46.9%；P＜0.05）。光合限制組分量化分析結(jié)果（表4）顯示，在Cd脅迫下龍葵葉片光合限速因子中，氣孔限制（SL）為17.86%，非氣孔限制（NSL）為82.14%。
表3 鎘脅迫對龍葵葉片光合參數(shù)的影響Table 3 Effects of Cd stress on photosynthetic parameters of Solanum nigrum (mean±SE)
表4 鎘脅迫下龍葵氣孔限制和非氣孔限制的比例Table 4 Photosynthesis limitation parameters in Solanum nigrum grown under Cd stress
2.4 鎘脅迫對龍葵生物量的影響
分析結(jié)果表明，不同處理下龍葵的生物量和SLW均服從正態(tài)分布且方差表現(xiàn)為齊性。由表5可知，鎘脅迫下龍葵單株生物量、地上部分生物量、根系生物量均顯著小于CK（P＜0.05），分別減小了46.8%、33.3%和49%。Cd脅迫對龍葵葉片SLW沒有顯著影響。Cd脅迫下龍葵根系/地上部分比例顯著高于CK（高31.5%；P＜0.05）。
分析結(jié)果表明，不同處理SPAD值與A不服從正態(tài)分布，采用Spearman秩相關(guān)分析；其余參數(shù)均服從正態(tài)分布，采用Pearson積矩相關(guān)分析。由表6可知，鎘脅迫下龍葵單株生物量、地上部分生物量與SPAD值、A、Amax、Vcmax、Jmax呈顯著相關(guān)關(guān)系。鎘脅迫下根系生物量與SPAD值、Amax、Vcmax、Jmax呈顯著相關(guān)關(guān)系。
表5 鎘脅迫對龍葵生物量和比葉重的影響Table 5 Effects of Cd stress on biomass and specific leaf weight of Solanum nigrum (mean±SE)
表6 鎘脅迫下龍葵生物量與光合參數(shù)的相關(guān)性分析?Table 6 Correlations between biomass and photosynthetic parameters of Solanum nigrum under Cd stress
由表7可知，龍葵葉片Amax與SPAD、Jmax、Vcmax、Rd呈顯著相關(guān)關(guān)系，A與SPAD、gsc顯著相關(guān)，SPAD與Jmax、Vcmax、gsc、Rd呈顯著相關(guān)關(guān)系，Vcmax與Jmax、gsc、Rd呈顯著相關(guān)關(guān)系，Jmax與gsc、Rd顯著相關(guān)。
3 結(jié)論與討論
光合作用是植物重要的生理過程。本研究表明，龍葵葉片光合速率（Amax和A）與生物量呈顯著相關(guān)關(guān)系，這說明光合作用于植株生物量累積密切相關(guān)。研究結(jié)果表明，Cd脅迫導(dǎo)致龍葵葉片最大凈光合速率（Amax）顯著下降，說明Cd脅迫導(dǎo)致龍葵葉片光合能力降低，這與Cd脅迫下垂柳[21]和烤煙[8]等的研究結(jié)果類似。大量研究表明，重金屬脅迫下光合速率的降低可能與光能的吸收、能量轉(zhuǎn)化、電子傳遞、Rubisco酶羧化反應(yīng)和葉片內(nèi)CO2擴(kuò)散等光合過程有關(guān)[8,10,16]。龍葵葉片Amax與SPAD、Jmax、Vcmax和Rd等參數(shù)顯著相關(guān)，說明龍葵光合作用的變化與葉綠素含量、光合電子傳遞、Rubisco羧化反應(yīng)、呼吸作用等密切相關(guān)。葉綠素是光合光反應(yīng)中的重要色素，可以反映葉片對光能的吸收和轉(zhuǎn)化能力。Cd脅迫下龍葵葉片的SPAD值顯著降低，表明其葉綠素含量下降，說明Cd脅迫可能抑制了龍葵葉片光合色素的合成，這與玉米[22]、美洲黑楊[10]的研究結(jié)果類似。這還可能與Cd脅迫下葉綠體數(shù)量的減少[23]、礦質(zhì)元素吸收受阻[24]有關(guān)。Cd脅迫下葉綠素含量的下降會直接導(dǎo)致龍葵葉片對光能的吸收和利用能力降低。Cd脅迫下龍葵葉片Rd顯著增大，說明葉片可能通過增加呼吸作用以獲得更多的能量來應(yīng)對鎘毒害，這與Cd脅迫下玉米[24]的研究結(jié)果類似。本研究發(fā)現(xiàn)Cd脅迫下龍葵葉片gsc和Ci減小，說明葉片氣孔阻力增大，這可能與Cd脅迫下氣孔密度和開放氣孔數(shù)的減少有關(guān)[13]。本研究還發(fā)現(xiàn)Cd脅迫導(dǎo)致龍葵葉片Vcmax和Jmax降低，這說明Cd毒害對葉片Rubisco酶羧化反應(yīng)和電子傳遞過程有一定的抑制作用，這與美洲黑楊[10]的研究結(jié)果類似。Vcmax的降低可能是由Cd脅迫下Rubisco酶活性的降低[14]和Rubisco酶基因表達(dá)水平的下降[25]而引起的。光合限制組分分析結(jié)果表明Cd脅迫下光合速率的限制主要來自于非氣孔限制（82.14%），這說明擴(kuò)散限制與生化限制的作用較大，這與滇苦菜[13]的研究結(jié)果類似。
表7 鎘脅迫下龍葵光合參數(shù)間相關(guān)性分析Table 7 Correlations between different photosynthetic parameters of Solanum nigrum under Cd stress
葉綠素?zé)晒鈪?shù)可以反映重金屬對光合機(jī)構(gòu)的脅迫程度。Fo可以反映PSII受到的損害程度。Fv/Fm為PSII最大光能轉(zhuǎn)化效率，反映葉片的光能轉(zhuǎn)化效率。研究結(jié)果表明，Cd脅迫下，龍葵葉片F(xiàn)o顯著增大，而Fv/Fm顯著下降，說明Cd脅迫導(dǎo)致龍葵葉片PSII受到損傷而降低了對光能的捕獲效率，這與Cd脅迫下滇潤楠[26]、烤煙[8]和美洲黑楊[10]等植物的研究結(jié)果類似。qP可以反映葉片吸收的光能，用于光合CO2固定和光呼吸等光化學(xué)過程的能量。NPQ則是反映不被用于光化學(xué)反映，而以熱能的形式釋放的能量，能防止過剩光能對光合機(jī)構(gòu)的傷害。本研究表明，Cd脅迫下龍葵葉片qP、NPQ與對照均無顯著差異，說明Cd脅迫對龍葵葉片吸收光能的分配機(jī)制沒有影響，這與大麥、玉米[12]和滇苦菜[13]等植物的研究結(jié)果類似。另一方面，LCP可以反映植物葉片對弱光的利用能力，AQY反映了葉片在弱光環(huán)境下的光合能力。惠俊愛等[27]發(fā)現(xiàn)Cd脅迫導(dǎo)致玉米葉片LCP升高、AQY降低，但本研究表明Cd脅迫對龍葵葉片LCP和AQY沒有顯著影響，這說明Cd脅迫下龍葵葉片對弱光的利用能力沒有改變。
重金屬脅迫對植物光合作用的限制可能與Rubisco酶含量及活性[14]、細(xì)胞色素f（cyt f）、ATP合酶等生理指標(biāo)有關(guān)。另一方面，重金屬脅迫下植物光合作用的變化還可能與氣孔大小及密度[16]、單位面積葉肉細(xì)胞暴露在胞間的面積和單位面積葉綠體暴露在胞間的面積等結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[28]有關(guān)。本研究僅從葉綠素?zé)晒夂凸夂仙匦苑矫鎭硌芯緾d脅迫對龍葵光合作用的影響，未能從生理特性和葉片結(jié)構(gòu)特點(diǎn)等多個方面來闡釋植物Cd污染的光合生理機(jī)制，未來擬結(jié)合生理指標(biāo)測定、光合生化模型模擬和葉片顯微結(jié)構(gòu)觀察等手段來研究Cd脅迫對植物光合作用的影響，以全面揭示Cd脅迫對植物光合作用的限制機(jī)理。
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