葉 鵬，李顯煌，唐軍榮，李 斌，張貴良，劉 成，雷 瀚，辛培堯

（1.西南林業(yè)大學(xué) a.西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.畢節(jié)市林業(yè)科學(xué)研究所，貴州 畢節(jié) 551700； 3.云南省大圍山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)河口管理分局，云南 河口 661399）

云南金花茶Camellia fascicularisH.T.Chang也叫云南顯脈金花茶或者簇蕊金花茶，為山茶科山茶屬金花茶組的一個(gè)種，是云南特有的一個(gè)極小種群植物[1]。云南金花茶現(xiàn)今只僅存在于云南的馬關(guān)、河口和個(gè)舊三個(gè)地方，數(shù)量極其稀少[2]。 云南金花茶的觀賞及藥用價(jià)值極高，但是關(guān)于它的相關(guān)研究較少，有報(bào)道僅見(jiàn)于繁育技術(shù)[3]、組培苗的移栽煉苗[4]以及金花茶的化學(xué)成分的研究[5]等方面，而對(duì)云南金花茶種質(zhì)資源的遺傳多樣性評(píng)價(jià)及保護(hù)方面的報(bào)道較少。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）又稱為微衛(wèi)星標(biāo)記，是一類由1到6個(gè)堿基串聯(lián)而成的重復(fù)DNA序列[6]。由于SSR標(biāo)記較其他分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、標(biāo)記數(shù)量多等優(yōu)點(diǎn)，通常被應(yīng)用于分子輔助育種、遺傳圖譜的繪制以及遺傳多樣性分析[7-11]。按照來(lái)源可分為轉(zhuǎn)錄組SSR和EST-SSR，前一種SSR是通過(guò)cDNA文庫(kù)構(gòu)建與克隆測(cè)序的方法獲得的，但是步驟較為復(fù)雜，工作量大且花費(fèi)較大[12]；后一種通過(guò)在公共數(shù)據(jù)庫(kù)搜索表達(dá)序列標(biāo)簽和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果來(lái)開(kāi)發(fā)[13]。目前，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，開(kāi)發(fā)SSR引物的方法，在木本植物中得到了廣泛的應(yīng)用[14]。而對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行SSR分布及序列特征的分析，可為后期引物的設(shè)計(jì)和篩選提供理論指導(dǎo)[15-16]。本研究采用Illumina HiSeqTM2000高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)云南金花茶轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，建立了其轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，并對(duì)SSR的分布及其序列特征進(jìn)行分析，研究結(jié)果可為EST-SSR引物的大量開(kāi)發(fā)以及利用SSR技術(shù)對(duì)云南金花茶群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，有望為其遺傳資源的保護(hù)提供分子水平的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗(yàn)材料采自云南省河口縣，海拔1 036 m，生長(zhǎng)在陽(yáng)坡的石灰?guī)r季節(jié)雨林地帶，受人為因素破壞嚴(yán)重。采集野生的云南金花茶，引種于西南林業(yè)大學(xué)智能溫室大棚，取其幼嫩葉片，迅速放入干冰中保存。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

將采集的云南金花茶幼嫩葉片送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3 序列拼接與SSR位點(diǎn)搜索

參考Manfred G Grabherr[17]的方法對(duì)云南金花茶轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果使用Trinity軟件進(jìn)行de novo組裝。使用MISA軟件對(duì)獲得的Unigene進(jìn)行SSR位點(diǎn)的搜索，搜索的標(biāo)準(zhǔn)為二核苷酸最少為6次，三核苷酸到六核苷酸最少搜索次數(shù)為5次，由于單核苷酸重復(fù)基元的SSR位點(diǎn)的實(shí)際應(yīng)用較少，因此不進(jìn)行篩選。經(jīng)篩選得到的序列使用Primer3軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)引物的主要原則是：引物長(zhǎng)度18～25 bp；退火溫度55～65 ℃；GC含量40%～60%；PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度100～500 bp；前后引物的退火溫度相差不超過(guò)5 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel軟件對(duì)云南金花茶轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)的出現(xiàn)頻率、重復(fù)單元的類型、基元組成以及SSR分布的平均距離統(tǒng)計(jì)分析，以此來(lái)分析云南金花茶的SSR分布和序列特征。其中，SSR位點(diǎn)的平均距離是得到的微衛(wèi)星總數(shù)和總Unigene的長(zhǎng)度之比；SSR的出現(xiàn)頻率是檢測(cè)到的微衛(wèi)星的總數(shù)與Unigene的總序列數(shù)量之比[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 云南金花茶轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)出現(xiàn)頻率和分布距離

通過(guò)對(duì)云南金花茶轉(zhuǎn)錄組的組裝，總共獲得155 011條去冗余的Unigene，總長(zhǎng)度是105 378.64 kb，G+C含量為42%。經(jīng)搜索發(fā)現(xiàn)30 435個(gè)SSR位點(diǎn)，SSR的出現(xiàn)頻率為19.63%。在這之中，有10 516條Unigene含有1個(gè)以上的SSR位點(diǎn)，云南金花茶轉(zhuǎn)錄組中平均3.46 kb就出現(xiàn)1個(gè)SSR位點(diǎn)（表1）。

2.2 云南金花茶轉(zhuǎn)錄組中SSR的基元類型

云南金花茶轉(zhuǎn)錄組中的SSR基元類型較為豐富，對(duì)云南金花茶轉(zhuǎn)錄組SSR的各個(gè)重復(fù)基元統(tǒng)計(jì)可知，重復(fù)率最高的基元類型為二核苷酸，占總數(shù)的71.44%；其次是三核苷酸，占總數(shù)的25.48%；四核苷酸到六核苷酸重復(fù)基元較低，并且四核苷酸重復(fù)基元要高于五核苷酸和六核苷酸。各重復(fù)類型SSR分布的平均距離方面，五核苷酸最高，為1 239.75 kb（每1 239.75 kb就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)五核苷酸SSR）；而二核苷酸的平均分布距離最低，僅為4.85 kb（每4.85 kb就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)二核苷酸SSR）。統(tǒng)計(jì)各個(gè)重復(fù)類型SSR出現(xiàn)的頻率發(fā)現(xiàn)，二核苷酸重復(fù)基元類型的出現(xiàn)頻率最高，為14.03%；而五核苷酸重復(fù)類型的出現(xiàn)頻率最低，僅為0.05%（表1）。

表1 云南金花茶轉(zhuǎn)錄組各SSR的分布特征Table 1 The distribution characteristics of various SSR in Camellia fascicularis

2.3 云南金花茶轉(zhuǎn)錄組中的SSR重復(fù)單元堿基的組成與比例

云南金花茶轉(zhuǎn)錄組中的SSR重復(fù)單元堿基的組成與比例情況列于表2。由表2可知，云南金花茶轉(zhuǎn)錄組SSR中，二核苷酸至六核苷酸出現(xiàn)的基元數(shù)分別為6、30、82、45、74種，總共有237種基元。其中，二核苷酸的主要重復(fù)基元是AG，占總SSR的15.91%（4 841個(gè)）；三核苷酸的主要重復(fù)基元是GAA，占總SSR的1.76%（537個(gè)）；四核苷酸的主要重復(fù)基元是AAAT，占總SSR的0.30%（90個(gè)）；五核苷酸的主要重復(fù)基元是CATTT，占總SSR的0.03%（10個(gè)）；六核苷酸的主要重復(fù)基元是CTCCAG、TCTTCC、TTGGTC，分別占總SSR的0.02%（6個(gè)）。其中，二核苷酸的主要重復(fù)基序是AG/TC，一共有8 142個(gè)，占總SSR的26.75%；其次是CT/GA，一共有7 662個(gè)，占總SSR的25.17%；而CG/GC最少，僅有32個(gè)，占總SSR的0.11%。三核苷酸的主要重復(fù)基序是CTT/GAA，一共有802個(gè)，占總SSR的2.63%；其次是AGA/TCT，一共有679個(gè)，占總SSR的2.23%；最少的是CGT/GCA，一共有87個(gè)，占總SSR的0.29%。四核苷酸的主要重復(fù)基序是AAAT/TTTA，一共有119個(gè)，占總SSR的0.39%；五核苷酸重復(fù)基序均較低，均在0.03%以下；而六核苷酸的重復(fù)基序均在0.02%以下（圖1）。

表2 云南金花茶轉(zhuǎn)錄組的SSR重復(fù)的基元序列特征Table 2 Characteristics of SSR repeat motifs sequence in transcriptome of Camellia fascicularis

2.4 云南金花茶轉(zhuǎn)錄組中各個(gè)基元重復(fù)次數(shù)

由表3可知，云南金花茶不同重復(fù)類型的重復(fù)次數(shù)主要為5～10次重復(fù)，占總SSR的98.54%。其中，占總SSR比例最多的是6次重復(fù)，共7 799個(gè)，占總SSR的25.63%；其次是7次重復(fù)與9次重復(fù)，分別占總SSR的17.68%（5 380個(gè)）與17.29%（5 262個(gè)）。其中，二核苷酸的6次重復(fù)比其他類型要高，并且從表3中可以看出，隨著次數(shù)的增加，SSR數(shù)量的出現(xiàn)頻率開(kāi)始降低。

2.5 云南金花茶轉(zhuǎn)錄組中基序長(zhǎng)度

圖2顯示，云南金花茶轉(zhuǎn)錄組中絕大部分的基序長(zhǎng)度集中在12～20 bp，共有28 089個(gè)，占總SSR的92.29%；而基序長(zhǎng)度在30 bp以上的共有91個(gè)，占總SSR的0.30%；基序長(zhǎng)度集中在21～30 bp的數(shù)量比在30 bp以上的略高，共有22 55個(gè)，占總SSR的7.41%?？係SR的平均長(zhǎng)度是16.47 bp，二核苷酸到六核苷酸的平均長(zhǎng)度分別為15.90、17.27、20.41、27.25、36.00 bp，且隨著基序長(zhǎng)度的增加，SSR的數(shù)量隨之減少。

圖1 云南金花茶轉(zhuǎn)錄組中不同的SSR基序類型比例Fig.1 Motif proportions of different SSR in Camellia fascicularis transcriptome

表3 云南金花茶轉(zhuǎn)錄組SSR不同重復(fù)類型的不同重復(fù)次數(shù)Table 3 Different repeat types SSR with different number of repeats in Camellia fascicularis transcriptome

圖2 云南金花茶轉(zhuǎn)錄組中SSR基序長(zhǎng)度的分布頻率Fig.2 Distribution frequency of SSR motif length in Camellia fascicularis transcriptome

2.6 云南金花茶轉(zhuǎn)錄組SSR引物設(shè)計(jì)與檢測(cè)

依據(jù)云南金花茶轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，使用Primer3軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)、合成，篩選出SSR引物50對(duì)，并對(duì)其進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增檢測(cè)。其中，部分SSR引物的PCR產(chǎn)物出現(xiàn)拖帶和多條帶的現(xiàn)象，表明這些引物擴(kuò)增出了非特異性的條帶；另有部分引物擴(kuò)增的條帶較暗或者無(wú)條帶，這說(shuō)明該引物不能很好的與模板DNA結(jié)合，其特異性并不強(qiáng)。最終，經(jīng)篩選只有14對(duì)引物可以擴(kuò)增出清晰、單一、明亮且無(wú)拖帶的條帶，擴(kuò)增效率為28.0%。這些引物可用于后期云南金花茶遺傳多樣性的分析。部分結(jié)果見(jiàn)圖3。

3 結(jié)論與討論

圖3 云南金花茶SSR引物的PCR擴(kuò)增凝膠電泳結(jié)果Fig.3 The PCR amplification gel electrophoresis result of SSR in Camellia fascicularis

基于對(duì)云南金花茶的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，一共獲得155 011條Unigene，經(jīng)過(guò)SSR位點(diǎn)搜索之后，共獲得二核苷酸到六核苷酸30 435個(gè)SSR位點(diǎn)，出現(xiàn)頻率為19.63%，平均分布距離為3.46 kb。該結(jié)果高于同屬的油茶Camellia oleifera（為14.73%）[15]和 四 球 茶Camellia tetracoccaZhang（為18.25%）[19]，但要略低于同屬金花茶組的崇左金花茶Camellia chuongtsoensisS.Y.Liang et L.D.Huang（為21.88%）[20]與薔薇屬的刺梨Rose roxburghiiTratt（20.37%）[21]，并且云南金花茶的平均分布距離要高于油茶[15]（3.30 kb）、四球茶[19]（2.64 kb）與刺梨[21]（1.68 kb），但要比崇左金花茶[20]（3.60 kb）略低。可以看出，云南金花茶轉(zhuǎn)錄組的SSR相對(duì)較高，說(shuō)明云南金花茶轉(zhuǎn)錄組中SSR的數(shù)量與種類較豐富。

通?；闹貜?fù)次數(shù)與基序長(zhǎng)度影響著SSR的多態(tài)性[22]。SSR位點(diǎn)的多態(tài)性主要是由基元重復(fù)次數(shù)和由堿基數(shù)量不同形成的不同序列的長(zhǎng)度。所以，SSR的長(zhǎng)度是影響多態(tài)性高低的主要因素[23-24]。云南金花茶轉(zhuǎn)錄組的基序長(zhǎng)度集中在12～30 bp，占總SSR的99.70%，其中基序長(zhǎng)度在12～20 bp的占大多數(shù)，占總SSR的92.29%；其次在21～30 bp，占總SSR的7.41%；大于30 bp的占總SSR的0.30%。依據(jù)Xu等[25]提出的理論，基序長(zhǎng)度存在著一個(gè)數(shù)值范圍，當(dāng)SSR的長(zhǎng)度在該范圍以上的傾向于收縮；而其長(zhǎng)度在該范圍以下則傾向于擴(kuò)張。而云南金花茶轉(zhuǎn)錄組的基序長(zhǎng)度大多數(shù)傾向于擴(kuò)張，所以云南金花茶轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所得的SSR位點(diǎn)大部分具有多態(tài)性的潛能，能夠用于云南金花茶的引物設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)。

目前，大多數(shù)的植物的轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)都以二核苷酸與三核苷酸為主，不同的只是主導(dǎo)重復(fù)基元。而云南金花茶轉(zhuǎn)錄組的SSR位點(diǎn)是以二核苷酸重復(fù)為主，占總SSR的71.44%。并且在云南金花茶轉(zhuǎn)錄組中，二核苷酸基序是以AG/TC為主，占總SSR的26.75%；在三核苷酸基序中則是以CTT/GAA為主，占總SSR的2.63%。而在油茶[15]、四球茶[19]中，二核苷酸主要重復(fù)基序與云南金花茶相同，三核苷酸主要重復(fù)基序則不同，分別為AAT/AAT與ACC/GGT。在崇左金花茶[20]、刺梨[21]、丹參Salvia miltiorrhizaBunge[26]、金銀花Lonicera japonicaThunb.[27]、黨參Codonopsis pilosula(Franch.) Nannf[28]等植物中，其二核苷酸、三核苷酸主要重復(fù)類型均與云南金花茶的相同，這種差異的產(chǎn)生原因可能與植物的物種不同有關(guān)。

從總體上來(lái)看，云南金花茶轉(zhuǎn)錄組的SSR出現(xiàn)頻率比較高，而SSR的類型也比較豐富，密度較大，多態(tài)性潛能較高。但就初步試驗(yàn)來(lái)看，其引物的擴(kuò)增效率僅為28.0%，擴(kuò)增效率較低，并且SSR標(biāo)記普遍存在著多態(tài)性低的缺點(diǎn)。由于根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以開(kāi)發(fā)出大量的SSR標(biāo)記，從而可以對(duì)上述缺點(diǎn)進(jìn)行一定的彌補(bǔ)，這就需要較多的工作來(lái)篩選更多的引物用于后續(xù)遺傳多樣性及變異結(jié)構(gòu)的分析。同時(shí)SSR標(biāo)記也是一種經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的分子標(biāo)記方法，比較適合云南金花茶的遺傳分析。因此，本試驗(yàn)研究結(jié)果可為云南金花茶SSR引物的設(shè)計(jì)、SSR遺傳多樣性分析以及種質(zhì)資源的遺傳保護(hù)提供重要的理論依據(jù)。