王保，姚嘉茵，魯義，卿朝輝，勞俊銘，劉棟，邱桂華，堯新華*

(1.廣州市中醫(yī)醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州 510130；2.中山大學附屬第六醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510655)

目前，糖尿病周圍神經(jīng)痛(diabetic peripheral neuropathy，DPN)的發(fā)病機制未明，治療手段有限[1,2]。臨床上極其需要針對DPN的持續(xù)且有效的治療方法。獐牙菜苦苷(Swertiamarin)是中藥龍膽草的主要活性成分之一，新近研究表明獐牙菜苦苷可有效保護神經(jīng)，減緩神經(jīng)病理性疼痛[3]。但是由于其作用的具體機制尚不明確，影響了其在DPN鎮(zhèn)痛領(lǐng)域的應用。本研究基于炎性應激反應層面，旨在研究獐牙菜苦苷對DPN大鼠血清炎性反應的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本研究經(jīng)本院動物實驗倫理審查。SPF級SD大鼠30只，體質(zhì)量200～220 g，由中山大學(北校區(qū))動物實驗中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK(粵)2017-0882。實驗環(huán)境：溫度保持在(25±1) ℃，光/暗環(huán)境每12 h循環(huán)一次，相對濕度為(55±10)%。大鼠顆粒飲食配方：74%碳水化合物、21%蛋白質(zhì)和4%脂肪。

1.2 動物模型的建立

采用鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma)腹腔注射法構(gòu)建DPN大鼠模型。大鼠實驗前先適應性喂養(yǎng)1周，開始實驗后，禁食12 h，腹腔注射STZ溶液(55 mg/kg)，48 h后測定大鼠尾靜脈血糖。血糖>16.7 mmol/L的大鼠為DPN模型組大鼠(經(jīng)熱輻射試驗、冷板試驗以及觸覺過敏試驗均證實模型組大鼠存在肢體反應潛伏期縮短、疼痛閾值下降等類似糖尿病周圍神經(jīng)痛的癥狀)。

1.3 動物分組與處理

采用隨機數(shù)字表法將30只大鼠分為空白組、DPN組及獐牙菜苦苷組。對DPN組和獐牙菜苦苷組進行DPN造模，造模后第7、14天，獐牙菜苦苷組按大鼠體質(zhì)量分別給予腹腔注射30 mg/kg獐牙菜苦苷(成都瑞芬思)；空白組與模型組分別腹腔注射30 ml/kg生理鹽水。造模后第14天結(jié)束實驗，所有大鼠麻醉下處死，取血加入抗凝管，離心后取上清液置于-70 ℃保存，用于檢測血清促炎因子TNF-α、IL-6 、IL-8以及抑炎因子IL-10、TGF-β的含量水平。

1.4 ELISA檢測

根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測各組大鼠血清促炎因子TNF-α、IL-6 、IL-8，抑炎因子IL-10、TGF-β的水平。

1.5 RT-PCR檢測

按照GenBank序列，用美國Invitrogen公司Vector NTI suite軟件核查并修改個別非配對堿基，交上海英俊生物工程公司合成，見表1。按Trizol試劑說明書進行試驗，使用美國Media Cybernetics公司Gel-Pro Analyzer 4.0軟件，計算待測細胞因子的GAPDH的光密度比值。

1.6 免疫印跡檢測

使用蛋白免疫印跡法檢測各組大鼠TNF-α、IL-6 、IL-8、IL-10、TGF-β蛋白表達，使用美國Media Cybernetics公司Gel-Pro Analyzer 4.0軟件半定量分析。

表1 PCR引物序列及擴增條件

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 血清炎性因子水平比較

DPN組促炎因子TNF-α、IL-6及IL-8高于空白組(P<0.05)；抑炎因子IL-10、TGF-β低于空白組(P<0.05)。獐牙菜苦苷組促炎因子TNF-α、IL-6及IL-8低于DPN組(P<0.05)；抑炎因子IL-10、TGF-β高于DPN模型組(P<0.05)；獐牙菜苦苷組TGF-β低于空白組(P<0.05)，見圖1。

2.2 血清炎性因子mRNA表達水平比較

DPN組促炎因子TNF-α、IL-6及IL-8高于空白組(P<0.05)；抑炎因子IL-10、TGF-β低于空白組(P<0.05)。獐牙菜苦苷組促炎因子TNF-α、IL-6及IL-8低于DPN組(P<0.05)；抑炎因子IL-10、TGF-β高于DPN組(P<0.05)。獐牙菜苦苷組促炎因子TNF-α、IL-6及IL-8高于空白組(P<0.05)；抑炎因子IL-10低于空白組(P<0.05)，但兩組TGF-β比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。

2.3 血清炎性因子蛋白表達水平比較

DPN組促炎因子TNF-α、IL-6及IL-8高于空白組(P<0.05)；抑炎因子IL-10、TGF-β低于空白組(P<0.05)。獐牙菜苦苷組促炎因子TNF-α、IL-6及IL-8低于DPN組(P<0.05)；抑炎因子IL-10、TGF-β高于DPN模型組(P<0.05)。獐牙菜苦苷組促炎因子TNF-α、IL-6高于空白組(P<0.05)；抑炎因子IL-10低于空白組(P<0.05)，兩組IL-8、TGF-β比較，差異無統(tǒng)計學意義，見圖3。

注：與DPN組比較，*P<0.05；與空白組比較，#P<0.05

圖1 3組大鼠血清炎性因子水平變化

注：與DPN組比較，*P<0.05；與空白組比較，#P<0.05

圖2 3組大鼠血清炎性因子mRNA表達水平的比較

注：與DPN組比較，*P<0.05；與空白組比較，#P<0.05

圖3 3組大鼠血清炎性因子蛋白水平表達

3 討論

糖尿病是威脅人類健康的三大慢性代謝性疾病之一，其中DPN發(fā)病率13%～26%，且逐年增長。目前，DPN尚無徹底治愈甚至短期控制的有效方法，對患者及社會造成沉重的心理及經(jīng)濟負擔[4,5]。炎癥反應在DPN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，有研究結(jié)果表明，TNF-α與DPN發(fā)病密切相關(guān)[6]。TNF-α的上調(diào)促進了一系列下游炎癥反應，導致神經(jīng)細胞損傷和脫髓鞘，最終導致周圍神經(jīng)功能障礙。使用TNF-α抑制劑后則減輕了DPN大鼠的神經(jīng)損傷。除了TNF-α外，還存在許多炎癥因素參與DPN的進程，包括IL-6、IL-8、IL-10及TGF-β。我們研究團隊既往研究發(fā)現(xiàn)，Toll-like受體(Toll-like receptor 4，TLR4)抑制劑TAK-242減少氧化應激、降低血糖水平，對DPN大鼠起治療作用，其機制是通過調(diào)節(jié)HGMB1/TLR4/MAPK信號通路，抑制促炎因子，促進抑炎因子表達，糾正免疫紊亂。我們團隊前期研究已驗證免疫因素在DPN致病中的重要作用[7-10]。

炎性因子按照功能不同分為促炎因子與抗炎因子，促炎因子包括TNF-α、IL-6以及IL-8等，抑炎因子包括IL-10以及TGF-β等。正常生理情況下，促炎因子與抗炎因子互相作用維持機體炎性因子相對平衡[11]。而在病理狀態(tài)下，促炎因子與抗炎因子的平衡一旦被打破，將誘發(fā)炎性活動及炎性級聯(lián)反應，導致慢性炎癥刺激引起神經(jīng)痛。因此，糾正炎性因子失衡是治療DPN的新靶點。

獐牙菜苦苷屬于新近出現(xiàn)的鎮(zhèn)痛藥物，現(xiàn)代學者對獐牙菜苦苷的藥理作用研究主要集中在鎮(zhèn)痛和保肝利膽方面[12]。研究表明獐牙菜苦苷可有效保護神經(jīng)，減緩病理性神經(jīng)疼痛[12-13]。其作用機制不明確。令我們關(guān)注的是，新近研究表明獐牙菜苦苷可調(diào)節(jié)NLRP3炎性小體信號通路[14]，這可能是其糾正炎性因子失衡治療DPN中的分子機制。

本實驗旨在研究獐牙菜苦苷對DPN大鼠血清炎性反應的影響。實驗采用STZ構(gòu)建DPN大鼠模型，因為 STZ無神經(jīng)毒性，適用于糖尿病相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的研究。實驗通過ELISA、RT-PCR以及免疫印跡三種方法檢測血清標本，結(jié)果顯示DPN模型組促炎因子水平高于空白組、抑炎因子低于空白組，提示在DPN中確實存在炎性因子失衡的狀況。而炎性因子失衡將進一步促進炎性級聯(lián)反應，引起慢性周圍神經(jīng)痛，這可能是DPN的致病因素之一。獐牙菜苦苷組促炎因子低于DPN模型組；抑炎因子均高于DPN模型組。提示獐牙菜苦苷可有效糾正DPN炎性因子失衡的狀況，減緩神經(jīng)病理性疼痛。獐牙菜苦苷組與空白組比較，部分炎性因子有統(tǒng)計學意義。這可能與獐牙菜苦苷干預的劑量和用藥持續(xù)時間相關(guān)，研究小組今后將繼續(xù)深入研究。

本研究結(jié)果表明獐牙菜苦苷可有效糾正DPN炎性因子失衡的狀況，減緩神經(jīng)病理性疼痛。其作用機制可能是通過促進抗炎因子表達，減少促炎因子表達，減少炎性因子級聯(lián)反應實現(xiàn)的。綜合以往研究結(jié)果，獐牙菜苦苷可以為DPN提供良好的鎮(zhèn)痛、抗炎作用，有望成為治療DPN的新藥物。