鮑錦庫(kù)，安偉通,，唐斌，孫承遠(yuǎn)，付松林，蘭序強(qiáng)

（1.四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川成都 610000；2.成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司，四川成都 610000）

白蛋白是人體血漿中含量最多的一種大分子蛋白質(zhì)，其具有多種生理功能，包括增加循環(huán)血容量和維持血漿所必需的膠體滲透壓[1]；作為載體運(yùn)送離子、營(yíng)養(yǎng)物、代謝物及其他化合物，促其發(fā)揮生理和藥理的作用[2]；作為人體重要的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)維持正常生命活動(dòng)發(fā)揮不可或缺的作用。20世紀(jì)40年代，低溫乙醇提取人血白蛋白工藝的出現(xiàn)[3]，使蛋白產(chǎn)品在各種醫(yī)療機(jī)構(gòu)中得以廣泛使用。

目前市場(chǎng)上大多數(shù)血液制品企業(yè)采用改良后的低溫乙醇工藝Cohn6/9法或N-K（Nitschmann-Kistlcr）法[4]，分離階段利用壓濾技術(shù)進(jìn)行固液相分離，實(shí)際上這是一種濾餅過(guò)濾和深層過(guò)濾技術(shù)相結(jié)合的過(guò)濾技術(shù)。濾餅過(guò)濾指固體堆積在濾材上并架橋形成濾餅層以攔截顆粒的過(guò)濾方式。深層過(guò)濾在介質(zhì)內(nèi)部進(jìn)行，由于顆粒比介質(zhì)孔徑小，顆粒進(jìn)入彎曲孔道被截留，從而達(dá)到固液分離的效果。

人血蛋白FV制作分離是血漿蛋白分離純化過(guò)程中重要分離步驟，為了能夠在過(guò)濾過(guò)程中保證過(guò)濾的效果，保證產(chǎn)品的質(zhì)量，除工藝參數(shù)的控制外，關(guān)鍵在于所選用的過(guò)濾介質(zhì)，即濾板。在FV的分離階段，多數(shù)生產(chǎn)企業(yè)所采用的為PALL公司的濾板A以及EATON公司的濾板B。

濾板A：專(zhuān)為血制品分離開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品，高純度濾材，濕強(qiáng)度高，纖維脫落少，Al/Fe離子析出量低，易于操作，濾板表面具有疏水性，易于蛋白回收，提高效率。濾板B：采用純度極高的原材料和特殊的生產(chǎn)工藝制成，內(nèi)毒素含量極低，可溶性離子的遷移程度降至最低，過(guò)濾活性和吸附力的完美結(jié)合能夠帶來(lái)最高的可靠性，確保始終如一的成品質(zhì)量。（如表1）

表1 A、B濾板參數(shù)比較

本文對(duì)生產(chǎn)過(guò)程中采用兩種濾板在過(guò)濾分離FV階段的過(guò)濾參數(shù)進(jìn)行了比較，對(duì)產(chǎn)品超濾收率數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，并對(duì)所得人血白蛋白成品的純度、多聚體含量等關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行了對(duì)比分析。

1 主要材料及設(shè)備

濾板A、濾板B、健康人血漿、壓濾機(jī)、濁度儀、DMA4100型密度儀、UV2450型島津紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、648ISO全自動(dòng)電泳儀、Agilent1200高效液相色譜儀。

2 比較方法

2.1 工藝流程

工藝流程如圖1所示。

2.2 過(guò)濾時(shí)間

從FV過(guò)濾開(kāi)始計(jì)時(shí)，至濾液過(guò)濾完壓濾機(jī)開(kāi)始吹干的時(shí)間為過(guò)濾時(shí)間，記錄兩種濾板過(guò)濾所用的時(shí)間t(h)。

2.3 過(guò)濾壓力

取FV過(guò)濾壓力趨于穩(wěn)定后的壓力作為過(guò)濾壓力，記錄兩種濾板過(guò)濾所用的壓力P(MPa)。

2.4 濁度

取過(guò)濾過(guò)程中前、中、后三階段濾過(guò)液，檢測(cè)濾過(guò)液濁度，每階段檢測(cè)3次，取最小值。

圖1 工藝流程圖

2.5 超濾收率

在FV精制、超濾后，檢測(cè)人血白蛋白原液的蛋白質(zhì)含量，對(duì)比相同工藝下使用兩種濾板進(jìn)行FV過(guò)濾所得的超濾收率情況。

2.6 多聚體含量

使用HPLC檢測(cè)人血白蛋白成品的多聚體含量，對(duì)比相同工藝下使用兩種濾板進(jìn)行FV過(guò)濾所得的產(chǎn)品中多聚體含量的情況。

2.7 純度

使用醋酸纖維素薄膜電泳法檢測(cè)人血白蛋白成品純度[5]，對(duì)比相同工藝下使用兩種濾板進(jìn)行FV過(guò)濾所得的產(chǎn)品純度情況。

3 結(jié)果與分析

3.1 過(guò)濾參數(shù)及收率結(jié)果

對(duì)兩種濾板分別進(jìn)行連續(xù)五批次生產(chǎn)使用。所得過(guò)濾參數(shù)及收率結(jié)果記錄如表2。

3.1.1 生產(chǎn)參數(shù)的比較

在工藝穩(wěn)定一致的條件下，使用A濾板時(shí)，平均過(guò)濾時(shí)間 2.6 h，標(biāo)準(zhǔn)差 σ=0.063；平均過(guò)濾壓力 0.27 MPa，標(biāo)準(zhǔn)差σ=0.009；平均濁度0.206 NTU，標(biāo)準(zhǔn)差σ=0.010。

使用B濾板時(shí)，平均過(guò)濾時(shí)間2.46 h，標(biāo)準(zhǔn)差σ=0.049；平均過(guò)濾壓力 0.246 MPa，標(biāo)準(zhǔn)差 σ=0.005；平均濁度0.198 NTU，標(biāo)準(zhǔn)差σ=0.007。

3.1.2 超濾收率

生產(chǎn)參數(shù)一致的條件下，使用A濾板時(shí)，超濾收率為（25.86±0.16）g/L；使用B濾板時(shí)，超濾收率為（25.94±0.16）g/L。兩組數(shù)據(jù)在α=0.05條件下，F(xiàn)檢驗(yàn)方差不同，P=0.872，無(wú)顯著差異，如圖2所示。

表2 過(guò)濾參數(shù)及收率結(jié)果

圖2 超濾收率

3.2 純度及多聚體含量結(jié)果

對(duì)使用兩種濾板所得產(chǎn)品的純度和多聚體含量進(jìn)行檢測(cè)，所得結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 純度、多聚體含量

3.2.1 多聚體含量

在工藝穩(wěn)定一致的條件下，使用A濾板時(shí)，多聚體含量為2.418%±0.102%；使用B濾板時(shí)，多聚體含量為2.408%±0.088%。兩組數(shù)據(jù)在α=0.05條件下，F(xiàn)檢驗(yàn)方差不同，P=0.729，無(wú)顯著差異，如圖3所示。

圖3 多聚體含量

3.2.2 純度

在工藝穩(wěn)定一致的條件下，使用A濾板時(shí)，純度為98.2%±0.1%；使用B濾板時(shí)，純度為98.0%±0.1%。兩組數(shù)據(jù)在α=0.05條件下，F(xiàn)檢驗(yàn)具有相同方差，繼而進(jìn)行T檢驗(yàn)，P=0.5，無(wú)顯著差異，如圖4所示。

圖4 純度

4 結(jié)論

從生產(chǎn)數(shù)據(jù)上看，A濾板與B濾板相差不大，它們擁有相近的孔徑，對(duì)于濾餅的形成效果近似，對(duì)于其他雜質(zhì)的去除效果近似，所以在濁度的檢測(cè)結(jié)果上表現(xiàn)的比較近似。過(guò)濾壓力和過(guò)濾時(shí)間兩方面，A濾板均超過(guò)B濾板，可能與板厚和過(guò)濾速度有關(guān)，但這種差異并不是非常明顯，且在可接受范圍內(nèi)。而且數(shù)據(jù)分析表明，使用兩種濾板后超濾收率并無(wú)顯著差異。所以兩種濾板具有相近的過(guò)濾性能。

產(chǎn)品質(zhì)量方面，使用A、B兩種濾板后，經(jīng)檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析，所得產(chǎn)品的多聚體含量及純度均無(wú)顯著差異?？梢?jiàn)在生產(chǎn)過(guò)程中使用兩種濾板可以得到質(zhì)量相近的產(chǎn)品。

市場(chǎng)上，A濾板應(yīng)用的較為廣泛，而B(niǎo)濾板擁有較薄的板厚和更大的濕強(qiáng)度，在相同過(guò)濾壓力下，B濾板出現(xiàn)破裂的風(fēng)險(xiǎn)更小，兩種濾板都有自己的優(yōu)勢(shì)。

通過(guò)5個(gè)批次人血白蛋白的生產(chǎn)過(guò)程和結(jié)果可以看到，兩種濾板過(guò)濾分離FV所得到的產(chǎn)品質(zhì)量符合《中國(guó)藥典》要求，且結(jié)果重現(xiàn)性良好。在FV的制作分離中，A、B兩種濾板可以互為替補(bǔ)，避免因供應(yīng)商原因影響生產(chǎn)過(guò)程，降低生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，減少風(fēng)險(xiǎn)源。