秦東升，王清磊，趙云（.四川大學，四川成都，60065；.成都蓉生藥業(yè)有限責任公司，四川成都，6004）

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低溫乙醇工藝制備人血白蛋白在FIV分離階段的影響分析
——基于BECO PR Steril40濾板替換50P濾板進行過濾

秦東升1，2，王清磊2，趙云1
（1.四川大學，四川成都，610065；2.成都蓉生藥業(yè)有限責任公司，四川成都，610041）

摘 要：本文為探討B(tài)ECO PR Steril40濾板進行FIV過濾所帶來的影響，在多批次的規(guī)?；a(chǎn)中，考察了人血白蛋白的超濾收率、純度、多聚體含量。對比兩種濾板對人血白蛋白原液的超濾收率和產(chǎn)品的純度、多聚體含量。實驗結(jié)果表明：采用低溫乙醇工藝制備人血白蛋白時，在FIV階段使用BECO PR Steril40濾板替換50P濾板進行過濾，其產(chǎn)品質(zhì)量表現(xiàn)出一定程度的提升，尤其表現(xiàn)在多聚體含量指標上；同時人血白蛋白超濾收率呈穩(wěn)定趨勢，未表現(xiàn)出明顯變化。使用BECO PR Steril40濾板進行FIV過濾對于血液制品生產(chǎn)企業(yè)提升人血白蛋白產(chǎn)品質(zhì)量具有積極意義。

關(guān)鍵詞：人血白蛋白；FIV；BECO PR Steril40濾板；超濾收率；純度；多聚體含量

引言

人血白蛋白是世界上商業(yè)化生產(chǎn)的第一種血液制品，其臨床應用至今已有70余年。人血白蛋白的生產(chǎn)工藝一直在發(fā)展和創(chuàng)新中，曾經(jīng)使用的鹽析法、利凡諾法都已被淘汰。目前絕大多數(shù)血液制品生產(chǎn)企業(yè)采用的為改良后的低溫乙醇工藝Cohn6/9法或N-K（Nitschmann-Kistlcr）法，利用壓濾技術(shù)取代離心技術(shù)用于血漿組分的分離［1，2］。

壓濾技術(shù)進行固液相分離工藝實際上是濾餅過濾和深層過濾技術(shù)的結(jié)合。濾餅過濾指固體堆積在濾材上并架橋形成濾餅層以攔截顆粒的過濾方式。深層過濾在介質(zhì)內(nèi)部進行，由于顆粒比介質(zhì)孔徑小，顆粒進入彎曲孔道被截留。

為了使生產(chǎn)中的制品溶液提高過濾性能和濾液澄清度，降低濾液濁度，吸附熱原質(zhì)、脂類、蛋白酶和變性蛋白等，從而保證制品的安全性和質(zhì)量，關(guān)鍵在于深層過濾時所使用的介質(zhì)——濾板。在血漿組分分離過程中所選用的濾板不同，不僅會對人血白蛋白的產(chǎn)品收率等經(jīng)濟性指標造成影響，同時也會對產(chǎn)品純度、多聚體含量等重要質(zhì)量屬性造成影響。因此，在使用低溫乙醇工藝制備人血白蛋白，在進行血漿組分分離時對于濾板的選擇是至關(guān)重要的。

目前國內(nèi)外血液制品企業(yè)所使用的濾板主要由美國3M、PALL、EATON等公司生產(chǎn)，其常用的型號有3M公司的60SP濾板、PALL公司的50P濾板以及EATON公司的BECO PX50A濾板等［3-5］。

1 材料與方法

低溫乙醇法制備人血白蛋白的工藝過程中，F(xiàn)IV制作分離是將白蛋白進行分離純化的重要步驟。FIV制作分離是將FI+II+III上清液經(jīng)過離子強度、pH值、乙醇濃度、溫度等調(diào)整后經(jīng)過適宜濾材和壓濾機進行過濾，該步驟將血漿中的FIV與FV進行分離，由于白蛋白存在于FV中，故FIV制作分離對于白蛋白的收率與質(zhì)量指標均有顯著影響［6］。目前FIV制作分離多采用美國PALL公司所生產(chǎn)的 50P濾板、EATON公司的BECO PX50A濾板等作為過濾介質(zhì)［7］。本研究采用美國EATON公司所生產(chǎn)的BECO PR Steril40濾板進行FIV的過濾分離，考察白蛋白的超濾收率、產(chǎn)品純度、多聚體含量指標，以探究在FIV階段使用BECO PR Steril40濾板替換50P濾板進行過濾對人血白蛋白收率和質(zhì)量的影響［8，9］。

1.1 材料與設備

5 0 P濾板（PA L L公司），B E C O P R Steril40濾板（EATON公司），95%醫(yī)用乙醇（吉林新天龍酒業(yè)有限公司），助濾劑（臨江益瑞石硅藻土有限公司、美國HARBORLITE公司），健康人血漿、注射用水（成都蓉生藥業(yè)有限責任公司），緩沖液（成都蓉生藥業(yè)有限責任公司）；壓濾機（EUROFILTEC FC.800.AC）、密度儀、電泳儀、HPLC［10，11］。

BECO PR Steril40濾板曾用于FI+III的分離過濾步驟，該濾板具有較強的吸附作用，能夠降低球蛋白中IgA等雜蛋白的含量，對提高IgG產(chǎn)品的分子大小分布有積極的作用。該濾板的主要技術(shù)參數(shù)為：厚度3.9mm，含灰率49%，濕強度＞50KPa，內(nèi)毒素含量＜0.125EU/ml。BECO PR Steril40濾板與PALL公司50P濾板的對比如表1所示。

表1 BECO PR Steril40濾板與PALL公司50P濾板的參數(shù)對比

1.2 實驗方法

在工藝穩(wěn)定的情況下，確保各項工藝參數(shù)的一致性，將FIV過濾用濾板由50P濾板替換為BECO PR Steril40濾板，進行了多批次的規(guī)?；a(chǎn)，對比人血白蛋白原液的超濾收率和產(chǎn)品的純度、多聚體含量，以考察換用BECO PR Steril40濾板進行FIV過濾所帶來的經(jīng)濟性和產(chǎn)品質(zhì)量兩方面的影響。制備人血白蛋白所采用的低溫乙醇工藝如圖1所示。

圖1 人血白蛋白生產(chǎn)工藝流程

1.2.1 超濾收率

在FV精制、超濾后，使用密度儀檢測人血白蛋白原液的蛋白質(zhì)含量，對比相同工藝下使用兩種濾板進行FIV過濾所得的超濾收率情況。

1.2.2 純度

使用醋酸纖維素薄膜電泳法檢測人血白蛋白成品純度，對比相同工藝下使用兩種濾板進行FIV過濾所得的產(chǎn)品純度情況。

1.2.3 多聚體含量

使用HPLC檢測人血白蛋白成品的多聚體含量，對比對比相同工藝下使用兩種濾板進行FIV過濾所得的產(chǎn)品中多聚體含量的情況。

2 結(jié)果

2.1 超濾收率

在工藝穩(wěn)定一致的情況下，統(tǒng)計了換板前18批使用50P濾板進行FIV過濾的人血白蛋白產(chǎn)品批次，其超濾收率為28.36±0.50g/L；統(tǒng)計了換板后18批使用BECO PR Steril40濾板進行FIV過濾的人血白蛋白產(chǎn)品批次，其超濾收率為28.37±0.50g/L，如表2所示。對這兩組數(shù)據(jù)進行獨立樣本T檢驗，95%置信區(qū)間為（-0.2083，0.1950），T值為-0.07，P值為0.945，無顯著差異，使用BECO PR Steril40濾板替換50P濾板進行FIV過濾的人血白蛋白原液超濾收率維持不變，如圖2所示。

圖2 18批次的超濾收率統(tǒng)計數(shù)據(jù)

2.2 純度

在工藝穩(wěn)定一致的情況下，統(tǒng)計了換板前18批使用50P濾板進行FIV過濾的人血白蛋白產(chǎn)品批次，其產(chǎn)品純度為98.11±0.11%；統(tǒng)計了換板后18批使用BECO PR Steril40濾板進行FIV過濾的人血白蛋白產(chǎn)品批次，其產(chǎn)品純度為98.23±0.12%。對這兩組數(shù)據(jù)進行獨立樣本T檢驗，95%置信區(qū)間為（0.2015， 0.4541），T值為5.48，P值為0.000，具有極顯著差異，使用BECO PR Steril40濾板替換50P濾板進行FIV過濾的人血白蛋白產(chǎn)品純度提升了0.11個百分點。更換濾板前后的人血白蛋白產(chǎn)品電泳如圖3所示，純度如圖4所示。

圖3 更換濾板前后的人血白蛋白產(chǎn)品電泳對比

圖4 更換濾板后的人血白蛋白產(chǎn)品純度

2.3 多聚體含量

在工藝穩(wěn)定一致的情況下，統(tǒng)計了換板前18批使用50P濾板進行FIV過濾的人血白蛋白產(chǎn)品批次，其產(chǎn)品多聚體含量為2.92±0.17%；統(tǒng)計了換板后18批使用BECO PR Steril40濾板進行FIV過濾的人血白蛋白產(chǎn)品批次，其產(chǎn)品多聚體含量為2.59±0.17%。對這兩組數(shù)據(jù)進行獨立樣本T檢驗，95%置信區(qū)間為（-0.1812，-0.0744），T值為-5.05，P值為0.000，具有極顯著差異，使用BECO PR Steril40濾板替換50P濾板進行FIV過濾的人血白蛋白產(chǎn)品多聚體含量下降0.33個百分點。更換濾板前后的人血白蛋白產(chǎn)品多聚體含量對比如圖5、圖6所示。

圖5 更換濾板前后的人血白蛋白產(chǎn)品電泳對比

圖6 更換濾板后的人血白蛋白產(chǎn)品多聚體含量

3 討論

BECO PR Steril40濾板替換50P濾板進行FIV過濾后最終得到的人血白蛋白產(chǎn)品各項質(zhì)量指標均達到或超過本公司和《中國藥典》的規(guī)定。實驗結(jié)果表明：采用低溫乙醇工藝制備人血白蛋白時，在FIV階段使用BECO PR Steril40濾板替換50P濾板進行過濾，其產(chǎn)品質(zhì)量表現(xiàn)出一定程度的提升，尤其表現(xiàn)在多聚體含量指標上——人血白蛋白產(chǎn)品的多聚體含量下降顯著，下降比例為11.3%。因此，隨著中國GMP 對血液制品原輔材料使用標準的提高，BECO PR Steril40濾板可替代50P濾板進行人血白蛋白FIV的過濾以用于血液制品的生產(chǎn)。同時，其人血白蛋白原液超濾收率呈穩(wěn)定趨勢，未表現(xiàn)出明顯變化，因此可以判斷使用該濾板進行FIV過濾對于血液制品生產(chǎn)企業(yè)的人血白蛋白產(chǎn)出不會造成明顯影響。

參考文獻

［1］ 王憬惺.血液制品學.北京：人民衛(wèi)生出版社，1998，31：40.

［2］ 倪道明.血液制品.北京：人民衛(wèi)生出版社，2013，63：170.

［3］Cohn E J，Strong LE，Huges WL，et al.Preparation and properties of serum and plasma proteins IV A system for the separation into fractions of the protein and lipoprotein components of biological tissues and fluids.Amer Chem Soc，1946，68：459-475.

［4］Kistler P， Nitschmann H.Large scale production of human plasma fractions.Eight years experience with the alcohol fractionation procedure of Nitschmann， Kistler and Lergier.Vox Sang，1962， 7：414-424.

［5］Hao YL：Pilot-plant scale preparation of human serum albunin.Vox Sang，1985， 49（1）：1～8.

［6］Meltzer， Theodore H.（EDT）/ Jornitz， Maik W.（EDT）.Filtration and Purification in the Biopharmaceutical Industry， 2nd Edition.informa heathcare.2008，6：33.

［7］Johann Schaller， Simon Gerber， Urs Kaempfer， Sofia Lejon，Christian Trachsel.Human Blood Plasma Proteins- Structure and Function.Wiley，2008，17：52.

［8］ 李津，俞霆，董德祥主編.生物制藥設備和分離純化技術(shù).北京：化學工業(yè)出版社，2003，357-366.

［9］FDA Process Validation： General Principles and Practices.2011.

［10］丁恩峰，高海燕，陳軍麗.FDA 最新工藝驗證指南正式版解析.醫(yī)藥工程設計，2011，32（6）：24～31.

［11］James Agalloco，F(xiàn)rederick J.Carleton.Validation of Pharmaceutical Processes（3rd），2008.

Effects of using BECO PR Steril40 instead of 50P to Filter FIV in Human Albumin Manufacturing by Cold Ethanol Fractionation

Dongsheng Qin1，2， Qinglei Wang2， Yun Zhao1
（1.Sichuan University， Chengdu， Chengdu， 610065， China；2.Chengdu Rong Sheng Pharmaceuticals Co.Ltd， Chengdu， Chengdu， 610041， China）

Abstract：In order to study the effects of using BECO PR Steril40 filter plate to filter FIV， surveyed the ultrafiltration yield， purity and content of polymer of human albumin through multi-batch of large-scale production.Compared the ultrafiltration yield， purity and content of polymer of human albumin with the two different filter plates.The study indicated that the quality of product showed a certain level of ascension， especially on the polymer content by using BECO PR Steril40 instead of 50P to filter FIV in human albumin manufacturing by cold ethanol fractionation.At the same time， the ultrafiltration yield of human albumin showed a trend of stability without obvious change.It has a positive significance to improve the quality of human albumin product by using BECO PR Steril40 filter plate to filter FIV.

Key words：Human Albumin； FIV； BECO PR Steril40 Filter Plate； Ultrafiltration Yield； Purity； Content of Polymer

中圖分類號：R954；R973

文獻標識碼：A

文章編號：2095-8412 （2016） 02-125-05

DOI：工業(yè)技術(shù)創(chuàng)新 URL： http//www.china-iti.com 10.14103/j.issn.2095-8412.2016.02.006

作者簡介：

秦東升（1976-），男，現(xiàn)從事于血液制品行業(yè)，就職于成都蓉生藥業(yè)有限責任公司，有17年的生產(chǎn)工作經(jīng)驗。同時為四川大學生命科學學院2012級在職研究生。

E-mail： qindongsheng@sinopharm.com

趙云（通訊作者），四川大學遺傳學專業(yè)博士，主要從事教學和油料植物的遺傳育種、分子生物學及其生物技術(shù)研究，先后參加或主持國家和四川省20多個科研項目。

E-mail： zhaoyun@scu.edu.cn