易 力，劉 璐，楊偉平，張海艷

（洛陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471934）

大腸桿菌又稱為大腸埃希氏菌，主要寄居在人和動(dòng)物的腸道內(nèi)，屬于正常菌群，僅具有特殊血清型的菌株存在致病性[1]。大腸桿菌病為人畜共患病，致病菌侵入人體和動(dòng)物體后，除引起腹瀉、腸炎，也可能會(huì)引起急性敗血癥，腹膜、膽囊等部位產(chǎn)生炎癥[2-3]。

隨著養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，人們常使用大量的抗生素來(lái)防治大腸桿菌病，抗生素濫用情況日趨加劇，目前已發(fā)現(xiàn)豬、雞、鴨等動(dòng)物源大腸桿菌對(duì)抗生素具有很強(qiáng)的耐藥性，給畜禽業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展帶來(lái)了隱患，使養(yǎng)殖成本和養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)提高[4-6]。在抑制腸源性大腸桿菌方面，中藥因具有抑菌效果好、毒性小、殘留少、不易引發(fā)菌株產(chǎn)生抗藥性，抗耐藥機(jī)制神秘突變，同時(shí)避免了抗生素對(duì)益生菌的殺滅等優(yōu)點(diǎn)，使得人們對(duì)其進(jìn)行深入研究，并逐步應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中[7-8]。

鑒于前人對(duì)中藥抑制腸源性大腸桿菌的研究不多，尤其是對(duì)魚源性和鵝源性大腸桿菌的抑制研究少之又少，所以本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定10 味中草藥對(duì)雞、魚、鵝3 種腸源性大腸桿菌的抑菌效果，來(lái)篩選出對(duì)腸源性大腸桿菌具有抑菌作用的有效中草藥，為預(yù)防和治療腸源性大腸桿菌病提供理論依據(jù)[9]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 中草藥

石榴皮、白術(shù)、黃芩、連翹、烏梅、黃連、柴胡、野菊花、金銀花、蒲公英10 味中草藥購(gòu)于洛陽(yáng)市一桿稱大藥房。

1.1.2 試驗(yàn)菌株

從雞糞、魚糞、鵝糞中分別分離腸源性大腸桿菌，備用[10]。

1.1.3 培養(yǎng)基EMB 固體培養(yǎng)基、LB 液、固體培養(yǎng)基，按常規(guī)方法配置，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.1.4 主要設(shè)備

96 孔微量反應(yīng)板、電子天平、立式高壓蒸汽滅菌鍋、振蕩培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、常溫高速離心機(jī)、Synergy H1酶標(biāo)儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的分離與保存

采集新鮮魚糞、雞糞和鵝糞，用0.85%無(wú)菌生理鹽水按照10倍梯度稀釋到10-9備用，選擇合適的稀釋度的稀釋液0.1 mL，涂布到EMB 平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察EMB 平板上呈深紫色有金屬光澤的單個(gè)典型菌落即為大腸桿菌初步分離株，將其接種于LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，將腸源性大腸桿菌保存于50%甘油:菌液=1:1的無(wú)菌甘油中，-20 ℃保存?zhèn)溆茫罱K保存雞源性大腸桿菌、魚源性大腸桿菌、鵝源性大腸桿菌各50株。

1.2.2 單味中草藥液制備

用電子天平稱取10 味中藥各25 g，10 味中草藥采取不同的制備方法。5 味中草藥（蒲公英、柴胡、黃芩、黃連、烏梅），分別放入添加200 mL蒸餾水的燒杯中浸泡1 h，使用電爐快速加熱至煮沸，改小火煎煮30 min，用4層紗布過(guò)濾藥液，藥渣加水100 mL煮沸后煎煮30 min，再次用4層紗布過(guò)濾藥液，合并兩次濾液，使用電爐小火濃縮至12.5 mL（即含藥量為2 g·mL-1），藥液分裝完做好標(biāo)記[11]。金銀花、連翹、烏梅、白術(shù)、野菊花根據(jù)參考文獻(xiàn)制備[12-15]。最后，將上述制備好的10味中草藥液于121 ℃高壓滅菌20 min，放入冰箱4 ℃保藏備用。

1.2.3 體外抑菌實(shí)驗(yàn)

藥敏片的制備：選用直徑為6 mm 的打孔器，制備直徑為6 mm的濾紙片，121 ℃高壓滅菌20 min后，烘箱干燥，然后將濾紙片置于中草藥液中浸泡24 h，將濾紙片取出于60 ℃烘箱烘干，制成藥敏片，置于無(wú)菌條件下保存?zhèn)溆肹16]。

菌懸液的制備：從3種腸源性大腸桿菌的50株菌株中各隨機(jī)選取某一株進(jìn)行活化，將菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用酶標(biāo)儀測(cè)定菌液OD600值，采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定菌液濃度，建立OD600值與菌液濃度對(duì)應(yīng)關(guān)系，用無(wú)菌生理鹽水稀釋菌液，使?jié)舛葹?08cfu·mL-1，作為試驗(yàn)的目標(biāo)菌懸液[14]。

K-B法抑菌實(shí)驗(yàn)：在超凈工作臺(tái)用移液槍吸取濃度為108cfu·mL-1的目標(biāo)菌懸液100 μL于配制好的固體LB 培養(yǎng)基平板，用涂布棒均勻涂布，用無(wú)菌鑷子取出藥敏片貼在含菌平板上，每個(gè)平皿放3個(gè)，每種藥敏片做3組對(duì)照。將培養(yǎng)皿置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑[17]。對(duì)抑菌效果較好的中草藥液進(jìn)行MIC值測(cè)定。

最小抑菌濃度MIC 的測(cè)定：使用二倍稀釋法，取100 μL 中草藥液，加入到滅菌的96 孔聚苯乙烯板第1豎列第1孔中，在第1豎列第2孔到第8孔均加入50 μL液體LB培養(yǎng)基，從第1孔吸50 μL藥液加入第2孔混勻，從第2孔吸50 μL藥液加入第3孔混勻，如此連續(xù)稀釋至第8 孔，并從第8 孔吸取50 μL 棄去，稀釋完成后，每孔加入50 μL 菌懸液濃度為108cfu·mL-1，使用蓋板，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，測(cè)OD600值，以完全抑制大腸桿菌生長(zhǎng)的最低中草藥液濃度為MIC值[18]。

最小殺菌濃度MBC 的測(cè)定：將上述96 孔聚苯乙烯板的液體取50 μL 涂布于固體LB 培養(yǎng)基平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后觀察，以無(wú)菌落生長(zhǎng)的最小藥液濃度為MBC[19]。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同中草藥液對(duì)腸源性大腸桿菌的抑制作用

選取石榴皮、白術(shù)、黃芩、連翹、烏梅、黃連、柴胡、野菊花、金銀花、蒲公英10 味中草藥，通過(guò)K-B 法對(duì)腸源性大腸桿菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)。抑菌結(jié)果的判定：抑菌圈直徑＜7.5 mm為耐藥；在7.5～10 mm 為輕度敏感；在10～14 mm 為中度敏感；在15～20 mm為高度敏感；＞20 mm為極度敏感[20]。

對(duì)雞源性大腸桿菌存在抑菌作用的5味中草藥的抑菌作用見(jiàn)表1。

表1 對(duì)雞源性大腸桿菌存在抑菌作用的5味中草藥的抑菌作用

由表1可知，當(dāng)藥液濃度為2.0 g·mL-1時(shí)，有5味中草藥（石榴皮、白術(shù)、黃芩、連翹、野菊花）對(duì)雞源性大腸桿菌具有抑菌作用且表現(xiàn)出不同程度的抑菌效果，抑菌圈直徑以石榴皮的抑菌作用最強(qiáng)，為中敏。其他5 味中草藥（黃連、柴胡、烏梅、金銀花、蒲公英）未表現(xiàn)出抑菌作用。由試驗(yàn)結(jié)果可知，有5 味中草藥對(duì)雞源性大腸桿菌存在抑菌作用，且抑制作用強(qiáng)弱順序?yàn)椋菏衿ぃ具B翹＞黃芩＞野菊花＞白術(shù)。

對(duì)魚源性大腸桿菌存在抑菌作用的4 味中草藥抑制效果見(jiàn)表2。

由表2可知，當(dāng)藥液濃度為2.0 g·mL-1時(shí)，有4味中草藥（石榴皮、白術(shù)、黃芩、柴胡）對(duì)魚源性大腸桿菌具有抑菌作用且表現(xiàn)出不同程度的抑菌效果，抑菌圈直徑以石榴皮、黃芩的抑菌作用較強(qiáng)，為中敏。其他6 味中草藥（連翹、烏梅、黃連、野菊花、金銀花、蒲公英）未表現(xiàn)出抑菌作用。由試驗(yàn)結(jié)果可知，有4味中草藥對(duì)魚源性大腸桿菌存在抑菌效果，且抑制作用強(qiáng)弱順序?yàn)椋菏衿ぃ军S芩＞白術(shù)＞柴胡。

表2 對(duì)魚源性大腸桿菌存在抑菌作用的4味中草藥的的抑制效果

對(duì)鵝源性大腸桿菌存在抑制作用的4味中草藥抑菌效果見(jiàn)表3。

由表3可知，當(dāng)藥液濃度為2.0 g·mL-1時(shí)，有4味中草藥（石榴皮、白術(shù)、連翹、烏梅）對(duì)鴨源性大腸桿菌具有抑菌作用且表現(xiàn)出不同程度的抑菌效果，抑菌圈直徑以石榴皮的抑菌作用最強(qiáng)，為中敏。其他6 味中草藥（黃芩、柴胡、黃連、野菊花、金銀花、蒲公英）未表現(xiàn)出抑菌作用。由試驗(yàn)結(jié)果可知，有4味中草藥對(duì)鴨源性大腸桿菌存在抑菌作用，且抑制作用強(qiáng)弱順序?yàn)椋菏衿ぃ具B翹＞烏梅＞白術(shù)。

表3 對(duì)鵝源性大腸桿菌存在抑制作用的4味中草藥的抑菌效果

2.2 中草藥液最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定結(jié)果

根據(jù)2.1試驗(yàn)結(jié)果選擇石榴皮、黃芩兩味中藥，通過(guò)二倍稀釋法測(cè)定其對(duì)腸源性大腸桿菌的MIC值。MIC 測(cè)定結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)，MIC＜7.82 mg·mL-1時(shí)，表現(xiàn)為高度敏感，7.82～250 mg·mL-1，表現(xiàn)為中度敏感，MIC＞250 mg·mL-1，表現(xiàn)為不敏感[21]。石榴皮藥液對(duì)腸源性大腸桿菌的MIC的測(cè)定、黃芩藥液對(duì)魚源性大腸桿菌的MIC的測(cè)定見(jiàn)表4、5。

表4 石榴皮藥液對(duì)腸源性大腸桿菌的MIC的測(cè)定

表5 黃芩藥液對(duì)魚源性大腸桿菌的MIC的測(cè)定

由表4可知，中草藥液石榴皮對(duì)雞源性、魚源性、鵝源性大腸桿菌的MIC均為0.5 g·mL-1。由表5可知，中草藥液黃芩對(duì)魚源性大腸桿菌的MIC值為1.0 g·mL-1。兩味中藥的MIC均為不敏感。

3 討 論

為研究中草藥對(duì)腸源性大腸桿菌的抑制作用，本試驗(yàn)在參考大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，選擇了具有清熱解毒、瀉下、補(bǔ)虛功效的中藥，有野菊花、連翹、蒲公英、金銀花等，采用水煎煮法制成中草藥液，進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，黃芩對(duì)魚源性大腸桿菌存在較強(qiáng)抑制作用，石榴皮對(duì)3種腸源性大腸桿菌均存在較強(qiáng)的抑制作用[22]。而黃連、連翹等中藥的抑菌作用不明顯或者不存在抑菌作用[23]。可能與以下因素有關(guān)：采用水煎煮法制備藥液，溫度、時(shí)間等因素控制不嚴(yán)格，使中草藥的成分造成破壞，抑菌作用減弱[24]；不同的提取劑也會(huì)對(duì)中藥功效造成影響，如本試驗(yàn)采用水提法提取的烏梅藥液，對(duì)腸源性大腸桿菌不存在抑制作用，而南平遙采用無(wú)水乙醇提取的烏梅藥液，對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出極度敏感的抑制作用[25]；不同炮制方法會(huì)影響中藥的功效，如劉騰飛等對(duì)黃連的研究表明，生黃連的抑菌作用強(qiáng)于酒制黃連，黃連超微粉水浸液的抑菌作用強(qiáng)于黃連水煎液[26]；同種中藥對(duì)不同菌種存在的抑菌作用不同，這也是黃芩只對(duì)魚源性大腸桿菌存在較強(qiáng)的抑制作用的原因；該試驗(yàn)選用的菌種是從分離得到的菌種中隨機(jī)選擇的，試驗(yàn)菌種是否具有耐藥性，致病性等并無(wú)研究。下一步將對(duì)菌種進(jìn)行一系列的生理生化指標(biāo)鑒定，采用多種方法制備中草藥液，探究抑菌效果的不同。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，石榴皮、黃芩的抑菌作用較強(qiáng)，這可能與其有效成分有關(guān)，舒揚(yáng)雄等研究表明，中草藥石榴皮的主要抗菌成分是單寧類物質(zhì)[27]。吳蕊等研究表明，中草藥黃芩的主要抗菌成分是黃芩苷和黃芩素[28]。因此如何將中草藥中的有效成分提取出來(lái)，是研究中草藥作用機(jī)理的下一步。

本試驗(yàn)對(duì)雞源性、魚源性、鵝源性大腸桿菌病的預(yù)防和治療具有指導(dǎo)作用。因中藥成分復(fù)雜，有效成分之間的相互關(guān)系不確定，以及復(fù)雜的綜合治療機(jī)制，因此要想確定某味中藥準(zhǔn)確的抑菌效果，為禽類疾病的預(yù)防和治療提供可靠的依據(jù)，必須結(jié)合體內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn)，共同探索中藥的抑菌機(jī)理[29]。