過(guò)雯婷 陳師師 何中央 薛 靜，2 戴志遠(yuǎn)，2*

（1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州310012 3 浙江省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站 杭州311100）

中華鱉，又名水甲魚(yú)、團(tuán)魚(yú)，肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，高蛋白、低脂肪[1]，其裙邊還含有豐富的膠原蛋白[2]，具有較大的的食用、藥用價(jià)值，全國(guó)各地已廣泛開(kāi)展人工繁育及養(yǎng)殖，以滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。傳統(tǒng)觀(guān)念下，消費(fèi)者更傾向于保活的鱉類(lèi)產(chǎn)品，活體運(yùn)輸成本高，長(zhǎng)途運(yùn)輸過(guò)程中車(chē)輛顛簸、氣溫波動(dòng)等環(huán)境因素增大了保活難度，個(gè)體死亡腐敗也會(huì)污染其它健康個(gè)體。采用獨(dú)立包裝，同時(shí)配合有效保鮮方法的包裝中華鱉產(chǎn)品具有較大的開(kāi)發(fā)潛力和較高的市場(chǎng)價(jià)值。氣調(diào)包裝是食品保鮮常用的方法之一，較之其它保鮮方法，該類(lèi)產(chǎn)品通常保質(zhì)期較長(zhǎng)，品質(zhì)穩(wěn)定可控，更貼合現(xiàn)代市場(chǎng)對(duì)商品的標(biāo)準(zhǔn)化要求。

微生物因素對(duì)水產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)起主要作用[3]，研究氣調(diào)包裝中華鱉貯藏期間菌相變化，對(duì)中華鱉貯藏保鮮技術(shù)的發(fā)展有著積極意義?，F(xiàn)今，高通量技術(shù)蓬勃發(fā)展，宏基因組學(xué)分析是研究環(huán)境微生物群落豐度、多樣性變化最有效的方法，廣泛應(yīng)用于農(nóng)學(xué)[4]、環(huán)境[5]、醫(yī)學(xué)[6-7]等學(xué)科的研究，在食品科學(xué)領(lǐng)域也逐漸受到關(guān)注。曹榮等[8]應(yīng)用高通量測(cè)序方法分析牡蠣微生物群落；魏泉增等[9]應(yīng)用宏基因組技術(shù)鑒定醬油曲真菌優(yōu)勢(shì)菌株；聶志強(qiáng)等[10]采用宏基因組學(xué)技術(shù)分析傳統(tǒng)食醋發(fā)酵過(guò)程微生物多樣性。目前，宏基因組學(xué)法在中華鱉貯藏保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用鮮有報(bào)道。本文采用宏基因組學(xué)法研究氣調(diào)包裝中華鱉在4 ℃貯藏過(guò)程中的菌相變化，旨在為中華鱉的貯藏保鮮提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料采集及預(yù)處理

新鮮中華鱉，購(gòu)于天福科技有限公司，質(zhì)量約700 g/只。鱉頸部放血致死，去除內(nèi)臟和脂肪塊，裝入KPET/PE 包裝袋中。根據(jù)前期研究結(jié)果確定氣調(diào)包裝氣體比例為50%CO2/50%N2，包裝氣體體積與鱉質(zhì)量體積比為3 mL ∶1 g。將樣品放在（4±1）℃冷藏箱中貯藏，于貯藏中期和末期取樣，新鮮原料直接留樣。

1.2 試驗(yàn)材料、儀器與設(shè)備

1.2.1 材料 限制性?xún)?nèi)切酶，寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖凝膠（分析純），西班牙進(jìn)口分裝；Taq DNA 聚合酶，TakaRa 寶成試劑有限公司；1 000 bp Marker，TakaRa 寶成試劑有限公司；EDTA （分析純），無(wú)錫市展望化工試劑有限公司；RNA 酶A，美國(guó)Sigma 公司；細(xì)菌基因組DNA 小量提取試劑盒，北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司。

1.2.2 儀器、設(shè)備 凝膠電泳儀，美國(guó)BIO-RAD公司；DZQ-F 氣體自動(dòng)混合機(jī)，張家港德順機(jī)械有限責(zé)任公司；DQB-360W 多功能氣調(diào)包裝機(jī)，張家港德順機(jī)械有限責(zé)任公司；Fresco21 微量離心機(jī)，美國(guó)Thermo 公司；Wide Mini-SubRCell GT水平電泳槽，美國(guó)BIO-RAD 公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；LRH-150-S 恒溫恒濕培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠(chǎng)。

1.3 宏基因組DNA 提取

參考ERMA D[11]的方法，適當(dāng)修改后提取宏基因組DNA。稱(chēng)取樣品5.0 g 于盛有50 mL 無(wú)菌生理鹽水的錐形瓶中，37 ℃恒溫?fù)u床振搖15 min（200 r/min），4 層無(wú)菌紗布過(guò)濾，收集濾液，離心（1 000 r/min，5 min，4 ℃），收集上清液，再次離心（8 500 r/min，5 min，4 ℃），棄上清液，取沉淀。使用細(xì)菌基因組DNA 小量提取試劑盒處理所得沉淀，具體步驟參考說(shuō)明書(shū)。提取的總DNA 采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度及純度。根據(jù)濃度檢測(cè)結(jié)果，采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 樣品的完整性（電壓120 V，電泳時(shí)間20 min）。

1.4 16S rDNA V4 區(qū)PCR 擴(kuò)增及Illumina 測(cè)序

從3 個(gè)樣品提取的基因組DNA 擴(kuò)增V4 區(qū)片段，PCR 擴(kuò)增引物為520F：5-AYTGGGYDTAAAGNG-3 和802R：5-TACNVGGGTATCTAATCC-3。

PCR 反應(yīng)體系：25 μL 樣品原液，8.75 μL 滅菌超純水，5.0 μL Q5 反應(yīng)緩沖 （5×），5.0 μL Q5 GC 高效增強(qiáng)劑（5×），2.0 μL dNTP（2.5 mmol/L），2.0 μL 模板（原液），1.0 μL 引物F（10 μmol/L），1.0 μL 引物R（10 μmol/L），0.25 μL Q5 聚合酶（5 U/μL）。

PCR 程序條件：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至杭州博訊生物科技有限公司進(jìn)行Illumina 雙末端測(cè)序，并以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行Illumina Mi-Seq 測(cè)序文庫(kù)的制備。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Illumina Mi-Seq 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。參考結(jié)合ERMA D[11]、Magoc T[12]、Caporaso J G 等[13]的方法，適當(dāng)改動(dòng)，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾，篩選獲取有效序列。經(jīng)過(guò)濾，去除嵌合體序列[14-15]，得到優(yōu)質(zhì)序列，用于后續(xù)分析。優(yōu)質(zhì)序列按序列相似度0.97，進(jìn)行OTU 聚類(lèi)，再對(duì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得每個(gè)OTU 代表序列的分類(lèi)學(xué)信息。對(duì)OTU表利用Qiime[16]生成不同分類(lèi)水平上（門(mén)、綱、目、科、屬）的物種豐度表和多樣品物種分布圖。根據(jù)OTU 列表中的各樣品物種豐度情況，計(jì)算4 種常用的生物Alpha 多樣性指數(shù) （Chao 指數(shù)、ACE 指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)），反映樣品物種多樣性程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 宏基因組DNA 提取及16S rDNA V4 區(qū)PCR 擴(kuò)增

3 組中華鱉樣品宏基因組DNA 質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。3 組中華鱉樣品的總基因組DNA 的含量在39.9～82.3 ng/μL，其OD260/280值1.61～1.79，OD260/230值1.00～1.20。這說(shuō)明獲得的總基因組DNA 濃度和純度較高。

表1 樣品宏基因組DNA 質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果Table 1 Quality results of Chinese soft-shelled turtle sample for metagenomic DNA

樣品宏基因組DNA 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，樣品條帶較為清晰，能夠滿(mǎn)足后續(xù)檢測(cè)要求。

以520F 和802R 為引物，對(duì)提取的樣品基因組16S rDNA V4 可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖見(jiàn)圖2。所有樣品均在250 bp 附近顯現(xiàn)較清晰的單一目的條帶，這說(shuō)明擴(kuò)增片段可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 樣品微生物基因組16S rDNA V4 可變區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of the PCR amplicons of V4 regions of 16S r DNA genes

2.2 Illumina MiSeq 平臺(tái)測(cè)序原始數(shù)據(jù)處理及質(zhì)量評(píng)估

采用Illumina MiSeq 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序和質(zhì)量過(guò)濾，再根據(jù)Index 信息篩選，獲取通過(guò)質(zhì)量過(guò)濾并與Index 完全匹配的有效序列。去除嵌合體序列后得到優(yōu)質(zhì)序列，樣品序列數(shù)統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表2。3 個(gè)樣品優(yōu)質(zhì)序列數(shù)在65 362～125 058 之間，長(zhǎng)度分布在223～235 之間，滿(mǎn)足分析要求。

表2 樣品序列數(shù)統(tǒng)計(jì)表Table 2 Sequence number data of different samples

2.3 OTUs 分析

OTU（Operational Taxonomic Units，操作分類(lèi)單元）[17]是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于分析，人為給某一個(gè)分類(lèi)單元（品系，屬，種、分組等）設(shè)置的同一標(biāo)志。將序列按照一定的相似性分歸為許多分類(lèi)單元，即OTU。OTU 聚類(lèi)分析，選取每個(gè)類(lèi)中最長(zhǎng)的序列為代表序列，對(duì)比序列數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得每個(gè)OTU 代表序列的分類(lèi)學(xué)信息，統(tǒng)計(jì)得到樣品在不同分類(lèi)水平下的OUT 數(shù)。由表3可知，3 個(gè)樣品在屬水平的OTU 數(shù)在941～1 046 之間。

2.4 Alpha 多樣性分析

Alpha 多樣性是指一個(gè)特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性。多樣性指數(shù)是反映物種豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)，包括Ace 指數(shù)、Chao 指數(shù)、Simpson 指數(shù)和Shannon 指數(shù)。群落豐富度（Community richness）的指數(shù)，包括Chao 指數(shù)和Ace 指數(shù)。Chao 指數(shù)由Chao[18]最早提出，在生態(tài)學(xué)中常用來(lái)估計(jì)物種總數(shù)。Ace 指數(shù)用來(lái)估計(jì)群落OTU數(shù)目的指數(shù)。Chao 指數(shù)或Ace 指數(shù)越大，群落豐富度越高。群落多樣性（Community diversity）的指數(shù)包括Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)。Shannon 指數(shù)[19]越大，群落多樣性越高。Simpson 指數(shù)由Edward Hugh Simpson[20]提出，其值越大，群落多樣性越低。3 組樣品Alpha 多樣性指數(shù)見(jiàn)表4。

由表4可知，根據(jù)Ace 指數(shù)和Chao 指數(shù)，在整個(gè)貯藏過(guò)程中，氣調(diào)包裝樣品的群落豐富度逐漸上升。根據(jù)Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)，氣調(diào)包裝樣品貯藏過(guò)程中物種多樣性中期前逐漸上升，之后明顯下降。氣調(diào)包裝對(duì)好氧微生物有明顯的抑制作用，其所占比例在貯藏中、后期逐漸降低；而一些對(duì)氣調(diào)環(huán)境適應(yīng)良好的微生物占比逐漸升高，并取得顯著優(yōu)勢(shì)，這些微生物是導(dǎo)致氣調(diào)包裝中華鱉腐敗的主要原因。

表3 不同分類(lèi)水平下的OTU 統(tǒng)計(jì)表Table 3 Statistical analysis of OTUs

表4 不同樣品的Alpha 多樣性Table 4 Alpha diversity metrics of different samples

2.5 中華鱉貯藏過(guò)程中細(xì)菌組成在門(mén)水平的變化

氣調(diào)包裝中華鱉不同貯藏階段微生物在屬水平上的組成和數(shù)量變化統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖3。中華鱉氣調(diào)包裝微生物主要為蛋白菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)。整個(gè)貯藏過(guò)程中，蛋白菌門(mén)總體呈先下降后上升趨勢(shì)；擬桿菌門(mén)呈先上升后下降趨勢(shì)；厚壁菌門(mén)雖先下降后上升，但最終與原料占比相近。

新鮮原料中蛋白菌門(mén)占42.09%，其次為擬桿菌門(mén)27.88%、厚壁菌門(mén)19.97%。中期樣品占比超過(guò)1%的微生物種類(lèi)最多，其中擬桿菌門(mén)40.84%，蛋白菌門(mén)29.19%，厚壁菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)、酸酐菌門(mén)、浮霉菌門(mén)分別占9.91%，5.83%，2.66%，2.46%。末期樣品中蛋白菌門(mén)占比大幅上升至59.01%，擬桿菌門(mén)降至12.59%，而厚壁菌門(mén)升至19.61%。

2.6 中華鱉貯藏過(guò)程細(xì)菌組成在屬水平上的變化

微生物是水產(chǎn)品腐敗的主要因素，然而只有少數(shù)幾種作為特定腐敗菌（SSOs）的微生物會(huì)導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗、散發(fā)腥臭味[26]。一般這些特定腐敗菌在新制作的水產(chǎn)品中數(shù)量和所占百分比都很低[26]，而后隨著pH、水分活度、氣體環(huán)境、溫度等環(huán)境條件的變化，微生物生長(zhǎng)繁殖速度、代謝方式等發(fā)生變化，成為數(shù)量、組成上的優(yōu)勢(shì)菌，從而導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)。從中華鱉新鮮原料共檢出498 個(gè)屬的微生物，氣調(diào)包裝中期604 個(gè)，氣調(diào)包裝末期591 個(gè)。氣調(diào)包裝中華鱉不同貯藏階段微生物在屬水平上的組成和數(shù)量變化統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖3 新鮮原料和氣調(diào)中、末期樣品在屬門(mén)水平上的菌相分布Fig.3 Microflora distribution of modified atmosphere packaging samples and fresh materials at phylum level

圖4 不同貯藏時(shí)期樣品在屬水平上的菌相分布Fig.4 Microflora distribution of samples at different storage period at genus level

結(jié)果表明：新鮮原料中優(yōu)勢(shì)微生物為細(xì)菌富集培養(yǎng)克隆AOM-SR-B4 屬 （bacterium enrichment culture clone AOM-SR-B4）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、脫硫葉菌屬（Desulfobulbus）和黃桿菌屬（Flavobacterium），所占比例分別為12.19%，11.36%，10.28%，9.82%。其中，假單胞菌屬產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)，如醛、酮、酯和硫化物，散發(fā)出特有的濃郁氨臭味[21-23]，是一種常見(jiàn)的水產(chǎn)品腐敗菌。其次，魏斯氏菌屬（Weissella）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、薄層菌屬 （Hymenobacter）、硫桿菌屬（Thiobacillus），分別占4.55%，3.30%，2.97%，2.63%。

氣調(diào)包裝中華鱉貯藏中期占比最高的菌屬為薄層菌屬（Hymenobacter）（11.33%），其次是黃桿菌屬 （Flavobacterium）（8.89%） 和假單胞菌屬（Pseudomonas）（8.25%）。中期樣品與新鮮原料相比，黃桿菌屬（Flavobacterium）（原料9.82%）和假單胞菌屬（Pseudomonas）（原料11.36%）百分比變化幅度不大，而薄層菌屬（Hymenobacter）在貯藏前期增長(zhǎng)明顯。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，以上3 個(gè)菌屬占比均有所下降，至貯藏末期分別為3.60%，2.17%，4.01%。

氣調(diào)包裝末期的優(yōu)勢(shì)菌屬為希瓦氏菌屬（Shewanella）（29.68%），其后依次為乳酸菌屬（Lactobacillus）（15.49%）和紫桿菌屬（Iodobacter）（11.9%）。其中希瓦氏菌屬在原料和中期占比極低，而在貯藏后期大量生長(zhǎng)繁殖。希瓦氏菌屬以研究水產(chǎn)品腐敗數(shù)十年的科學(xué)家James M Shewan命名[24]，是一種常見(jiàn)的導(dǎo)致水產(chǎn)品劣化的腐敗微生物。希瓦氏菌屬代謝會(huì)產(chǎn)生H2S，并能夠?qū)MAO 分解成TMA，而TMA 是水產(chǎn)品腥臭味產(chǎn)生的主要原因[25-26]。研究表明[26]，TMAO 的分解對(duì)水產(chǎn)品腐敗的影響在缺乏氧氣的條件下更加明顯，這與氣調(diào)包裝樣品隨著希瓦氏菌屬的大量繁殖而進(jìn)入貯藏末期相符。希瓦氏菌屬（Shewanella）和假單胞菌屬（Pseudomonas）是水產(chǎn)品常見(jiàn)的特定腐敗菌（SSOs）[27]，氣調(diào)包裝雖有效抑制了假單胞菌屬（Pseudomonas），但不能很好地抑制希瓦氏菌屬（Shewanella），這與Dainty 等研究結(jié)果相一致[28]。

根據(jù)前期研究結(jié)果：新鮮中華鱉肌肉的初始pH6.3，氣調(diào)包裝在貯藏18 d 后pH 上升至6.77。希瓦氏菌屬為pH 敏感菌，適宜在pH＞6 的高pH環(huán)境下生存[27]，這是導(dǎo)致希瓦氏菌屬在貯藏中后期大量繁殖的因素之一。假單胞菌屬為嚴(yán)格需氧菌，在缺乏氧氣供應(yīng)的氣調(diào)環(huán)境下生長(zhǎng)繁殖受到明顯抑制，而希瓦氏菌屬屬兼性厭氧菌，氣調(diào)環(huán)境對(duì)其生長(zhǎng)繁殖沒(méi)有明顯的抑制作用。黃桿菌屬（Flavobacterium）廣泛存在于淡水、海水中，在水產(chǎn)品中很常見(jiàn)，與假單胞菌屬（Pseudomonas）相同，黃桿菌屬（Flavobacterium）也是一種嚴(yán)格厭氧菌，由圖4可知，氣調(diào)包裝對(duì)黃桿菌屬微生物也有較強(qiáng)的抑制作用。乳酸菌（Lactobacillus，15.49%）為兼性厭氧菌，低氧含量或厭氧條件有利于其生長(zhǎng)繁殖，在整個(gè)貯藏過(guò)程中逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌之一。此外，新鮮原料中占比較大的細(xì)菌富集培養(yǎng)克隆AOM-SR-B4 屬和脫硫葉菌屬（Desulfobulbus），在4 ℃氣調(diào)包裝貯藏條件下也均得到有效的抑制。

3 結(jié)論

采用宏基因組學(xué)法分析氣調(diào)包裝中華鱉在4℃貯藏期間的微生物群落組成及豐度。在整個(gè)貯藏過(guò)程中，氣調(diào)包裝樣品的群落豐富度逐漸上升，物種多樣性呈先上升后下降趨勢(shì)。氣調(diào)包裝末期的優(yōu)勢(shì)菌屬為希瓦氏菌屬 （Shewanella）（29.68%）和乳酸菌（Lactobacillus）15.49%，其在貯藏初期處于劣勢(shì)狀態(tài)，因其對(duì)氣調(diào)包裝環(huán)境有很強(qiáng)的適應(yīng)能力，故得以快速生長(zhǎng)繁殖，逐漸成長(zhǎng)為優(yōu)勢(shì)菌。氣調(diào)包裝能有效抑制假單胞菌屬（Pseudomonas）、黃桿菌屬（Flavobacterium）等水產(chǎn)品中常見(jiàn)的腐敗微生物，從而維持產(chǎn)品新鮮品質(zhì)，是中華鱉包裝貯藏的優(yōu)良選擇。