馮曉玲 賈 丹 劉慶麗 張 楊

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 150040)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是指與同一個配偶連續(xù)發(fā)生2次及以上的自然胚胎丟失或停止發(fā)育[1]。本病的病因復(fù)雜，除遺傳因素、子宮畸形和子宮肌瘤等解剖學(xué)因素、內(nèi)分泌因素、生殖道感染因素、免疫因素、血栓形成傾向以及環(huán)境因素外，另外還有大約40%的患者病因不明，稱為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(Unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)[2]。隨著對本病認(rèn)識的深入，研究發(fā)現(xiàn)免疫因素是導(dǎo)致URSA發(fā)生的直接因素，其中Th1/Th2失衡是導(dǎo)致本病發(fā)生的主要原因[3]。祖國醫(yī)學(xué)對本病有了更深入的認(rèn)識，補(bǔ)腎活血法治療URSA患者也取得了顯著的臨床療效，本文通過臨床研究,探討補(bǔ)腎活血方對URSA患者外周血中IL-12和IFN-γ的影響。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1URSA患者 2016年2月～2017年2月期間就診于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院URSA患者61例作為研究對象，排除患有精神疾病不能完成治療及患有肝腎功能異常、風(fēng)濕等全身系統(tǒng)疾病，兩組病例年齡及孕周比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書?；颊吣挲g23～41歲，平均年齡(30.75±4.02)歲，停經(jīng)周數(shù)為6～8周。分為補(bǔ)腎活血方聯(lián)合地屈孕酮31例(URSA-1)，其中治療期間1例未按要求治療，和單用地屈孕酮30例(URSA-2)。

1.1.2URSA妊娠失敗患者 2016年2月～2017年2月期間就診于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院的URSA妊娠失敗患者15例作為實(shí)驗(yàn)組(URSA-3),納入標(biāo)準(zhǔn)為年齡22～42歲，妊娠<12周者，符合早期URSA西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)及中醫(yī)腎虛血瘀證證候診斷標(biāo)準(zhǔn)而未經(jīng)任何治療URSA流產(chǎn)者。排除標(biāo)準(zhǔn)為不符合納入病例標(biāo)準(zhǔn)者，如胚胎染色體核型分析異常和病因明確者?；颊吣挲g23～40歲，平均年齡(32.33±4.74)歲，停經(jīng)周數(shù)為6～10周，正常妊娠人工流產(chǎn)患者15例作為對照組(Control)，納入標(biāo)準(zhǔn)為患者年齡和妊娠周數(shù)同上并且為正常妊娠，無自然流產(chǎn)史，有一次或一次以上正常生育史，既往生育子女均健康，夫妻無遺傳病史，此次妊娠狀況良好，實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及超聲正常，要求進(jìn)行人工流產(chǎn)患者。排除標(biāo)準(zhǔn)為首次妊娠婦女；有保胎意愿；胚胎染色體核型分析異常者；實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及超聲有異常者。年齡29～41歲，平均(33.80±3.74)歲，孕周范圍為6～10周。本研究已獲得倫理委員會批準(zhǔn)，并在獲得患者知情同意后，收集患者蛻膜組織。

1.2方法

1.2.1給藥方式 URSA-1患者給予補(bǔ)腎活血方聯(lián)合地屈孕酮口服治療4周。URSA-2患者單獨(dú)給予地屈孕酮口服治療4周。中藥補(bǔ)腎活血方，藥物如下:丹參15 g，菟絲子15 g，續(xù)斷15 g，桑寄生15 g，阿膠(烊化)10 g，黃芪15 g。根據(jù)患者情況隨證加減，日一劑200 ml水煎服，早晚分服，以上中藥湯劑均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥局及煎藥室提供。地屈孕酮片:10 mg，口服2次/d，從住院開始服用，服用4周。地屈孕酮片(達(dá)芙通，荷蘭Abbott Healthcare Products BV公司)國藥準(zhǔn)字H20130110，規(guī)格10 mg/片。

1.2.2ELISA檢測 URSA-1組和URSA-2組患者入組前以及入組4周后均采血，統(tǒng)一應(yīng)用ELISA法檢測患者血清中IL-12、IFN-γ的水平。使用Human IL-12 ELISA試劑盒和Human IFN-γ ELISA kit試劑盒(江蘇科特生物科技有限公司)，具體操作步驟均按照試劑盒步驟進(jìn)行。

1.2.3RT-PCR檢測 分別收集URSA-3組和Control組早孕期婦女行人工流產(chǎn)的蛻膜組織，用RT-PCR方法檢測兩組患者蛻膜組織中的IL-12Rβ1、IL-12Rβ2、IFN-γR mRNA的表達(dá)量。TRizol購自Invitrogen公司，M-MLV Reverse Transcriptase購自Promega公司。RT-PCR使用2×SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒(BIOTOOL)。具體操作步驟按照說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用比較Ct法定量，2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達(dá)量。ΔCt =Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt待測樣品-ΔCt對照組。將逆轉(zhuǎn)錄得到的完整cDNA模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，以此設(shè)定的程序運(yùn)行RT-PCR儀，由此得出擴(kuò)增曲線。

1.2.4妊娠結(jié)局與隨訪情況比較 截止2018年1月，剔除本研究中脫落的患者，對其余患者進(jìn)行電話隨訪調(diào)查，URSA-1組有1例患者在妊娠32周左右時產(chǎn)檢發(fā)現(xiàn)胎盤老化住院治療，治療后分娩一名健康胎兒；2例患者在妊娠14周左右出現(xiàn)陰道流血不止，發(fā)生難免流產(chǎn)，胎兒做染色體核型分析均未見異常。余皆無明顯不適，分娩健康胎兒中，Apgar評分8～10分。URSA-2組有3例患者妊娠14周左右，發(fā)現(xiàn)胎兒停止發(fā)育，妊娠約12周；2例患者妊娠15周左右出現(xiàn)陰道流血量增多，腹痛不止，發(fā)生難免流產(chǎn)；3例患者妊娠21周左右行超聲檢查，發(fā)現(xiàn)無胎心，胎兒做染色體核型分析均未見異常；余皆分娩健康胎兒，Apgar評分8～10分。

2 結(jié)果

2.1URSA-1組和URSA-2組患者血清中IL-12、IFN-γ的水平

2.1.1外周血中IL-12標(biāo)準(zhǔn)曲線 ELISA法測定兩組臨床患者血清中IL-12水平，與標(biāo)準(zhǔn)品對照后吸光度曲線如圖1、表1所示。

2.1.2外周血中IFN-γ標(biāo)準(zhǔn)曲線 ELISA法測定兩組臨床患者血清中IFN-γ水平，與標(biāo)準(zhǔn)品對照后吸光度曲線如圖2、表2所示。

2.2URSA-3組和Control組患者流產(chǎn)蛻膜組織中IL-12Rβ1、IL-12Rβ2、IFN-γR組擴(kuò)增曲線 我們通過RT-PCR法測定URSA組與Control組流產(chǎn)蛻膜組織中IL-12Rβ1、IL-12Rβ2、IFN-γR的含量，使用軟件繪制出各項(xiàng)觀測指標(biāo)的擴(kuò)增曲線(圖3、4)。

GroupsnBefore treatmentAfter treatmenttPURSA-13041.65±11.4532.52±9.071)12.1010.000URSA-23043.82±11.70 37.71±10.472)3)10.2000.000

Note：Compared with the URSA-1 before treatment,1)P<0.01；compared to the URSA-2 before treatment,2)P<0.01；compared with the URSA-1 after treatment,3)P<0.01.

圖2 URSA-1組和URSA-2組患者血清中IFN-γ水平曲線圖Fig.2 Serum IFN-γ level curve in URSA-1 group and URSA-2 group patients

GroupsnBefore treatmentAfter treatmenttPURSA-13037.87±9.4727.92±7.641)3.9030.000URSA-230 39.68±10.1233.08±8.892)3)2.7450.000

Note：Compared with the URSA-1 before treatment,1)P<0.01；compared to the URSA-2 before treatment,2)P<0.01；compared with the URSA-1 after treatment,3)P<0.01.

圖3 URSA-3組和Control組患者流產(chǎn)蛻膜組織中IL-12Rβ1、IL-12Rβ2和IFN-γR擴(kuò)增曲線Fig.3 Amplification curves of IL-12Rβ1，IL-12Rβ2 and IFN-γR in decidua tissue of abortion in URSA-3 group and Control groupNote: nt is the control group,ut is the URSA group.

圖4 GAPDH擴(kuò)增曲線Fig.4 GAPDH amplification curvesNote: nt is the control group,ut is the URSA group.

表3 URSA-3組與Control組蛻膜組織中IL-12Rβ1、IL-12 Rβ2和IFN-γR mRNA相對表達(dá)量

Tab.3 Relative expression of IL-12Rβ1，IL-12Rβ2 and IFN-γR mRNA in decidua tissues of URSA-3 group and Control group

GroupsnIL-12Rβ1 mRNAIL-12Rβ2 mRNAIFN-γR mRNAControl150.69±0.270.59±0.160.62±0.16URSA-3151.81±0.291.13±0.250.99±0.22P0.0000.0070.000

表4 URSA-1組和URSA-2組臨床妊娠結(jié)局比較

Tab.4 Total clinical efficacy of URSA-1 group and URSA-2 group

GroupsnLive birth babyabortionTotal effective rate(%)URSA-13028293.3URSA-23022873.3

2.3URSA-3與Control組蛻膜IL-12Rβ1、IL-12β2、IFN-Rγ mRNA表達(dá)比較 兩組URSA患者的蛻膜組織中，URSA-3組中IL-12Rβ1、IL-12Rβ2、IFN-Rγ mRNA表達(dá)均高于Control組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

2.4妊娠結(jié)局及隨訪情況比較 總療效如表4所示，兩組相比臨床保胎成功率差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明URSA-1組與URSA-2組相比，臨床療效更好。

3 討論

近年來生殖免疫學(xué)的研究越來越深入，免疫因素在生殖中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，而且發(fā)現(xiàn)URSA的發(fā)生可能與母胎界面間免疫耐受機(jī)制相關(guān)，是免疫排斥的結(jié)果。URSA這種病理性妊娠可能是因?yàn)榧?xì)胞因子的分泌異?；蛘吣柑ソ缑婢植考?xì)胞功能異常引起的。

正常妊娠期，母體的各項(xiàng)機(jī)能都會發(fā)生相應(yīng)變化，尤其是免疫功能方面，包括特異性的免疫抑制、抑制性T細(xì)胞和非特異性因子維持正常妊娠。這種環(huán)境一旦被打破，母體就會對胎兒產(chǎn)生免疫排斥，進(jìn)而可能引起妊娠失敗[4,5]。近年來，學(xué)者們對URSA的生殖免疫學(xué)因素進(jìn)行了諸多研究，發(fā)現(xiàn)與免疫相關(guān)的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)可以分為自身免疫型和同種免疫型，同種免疫型又稱原因不明型。同種免疫型URSA與母胎界面免疫耐受不平衡具有相關(guān)性，同種免疫型URSA的原因包括Th1與Th2細(xì)胞因子的失衡、封閉抗體低下、NK細(xì)胞活性及亞型表達(dá)異常、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞表達(dá)異常等。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一類具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞型,表達(dá)CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的亞型起源于胸腺[6]，在機(jī)體的免疫耐受和調(diào)控免疫應(yīng)答中發(fā)揮不可忽視的作用[7]。妊娠期間胎兒所攜帶的抗原能夠被母體的抗原呈遞細(xì)胞所識別，并呈遞給特定的CD4+T細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞受到刺激后分化為Th1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，從而在母胎界面形成特定的免疫微環(huán)境。Th1型細(xì)胞因子主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng),產(chǎn)生胚胎排斥作用；Th2細(xì)胞因子主要促進(jìn)抗體生成和介導(dǎo)體液免疫，起到抗炎性反應(yīng)的作用，對Th1細(xì)胞有抑制作用，故對妊娠有利。Th1/Th2細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控這兩種免疫應(yīng)答，其過程和方式錯綜復(fù)雜。相關(guān)文獻(xiàn)報道，流產(chǎn)的發(fā)生與Th1/Th2的偏移密切相關(guān)，正常妊娠需要Th1/Th2保持平衡，打破這種平衡，將導(dǎo)致URSA的發(fā)生[8,9]。Th1型細(xì)胞主要分泌IL-2、 IL-12、TNF-α等細(xì)胞因子，Th2型細(xì)胞主要分泌粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、IL-4、 IL-6等因子[10]。

IL-12是一種由淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和其他抗原呈遞細(xì)胞產(chǎn)生的通過二硫鍵將分子量35 kD(P35)和40 kD(P40)兩個亞基結(jié)合組成的一種細(xì)胞因子，是白介素家族中的一員。IL-12與其受體(IL-12Rβ1和IL-12Rβ2兩個鏈構(gòu)成的異二聚體)之間具有很高的親和力。P40亞單位是可溶性的蛋白，且為誘導(dǎo)性表達(dá)，與免疫細(xì)胞表面對應(yīng)的受體IL-12Rβ1相結(jié)合；而P35亞基為組成性低水平表達(dá)，與對應(yīng)的受體IL-12Rβ2相結(jié)合并產(chǎn)生免疫傳導(dǎo)信號。IL-12有多種生物活性，在機(jī)體炎性反應(yīng)早期和感染時期即可產(chǎn)生，其中最主要的生物學(xué)特性是調(diào)節(jié)Th細(xì)胞亞群的平衡。IL-12是連接抗原特異適應(yīng)性免疫與先天免疫應(yīng)答的關(guān)鍵因子，在細(xì)胞免疫應(yīng)答的過程中起調(diào)節(jié)作用，并且可以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫排斥反應(yīng)。國內(nèi)外研究證明，IL-12水平的異常與URSA的發(fā)生具有相關(guān)性[11,12]。

研究者在1965年發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞培養(yǎng)上清液中有IFN樣抗病毒物質(zhì)，另一團(tuán)隊在1973年于淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中也發(fā)現(xiàn)干擾素存在，1980年將其命名為IFN-γ。IFN-γ主要由活化的T細(xì)胞及NK細(xì)胞產(chǎn)生，亦屬于Th1型細(xì)胞因子，可以抑制Th2細(xì)胞增生。相關(guān)研究證明，URSA患者外周血中IFN-γ水平相比于正常未孕婦女明顯升高。IFN-γ導(dǎo)致流產(chǎn)可能通過以下多種途徑，一方面促進(jìn)Th0向Th1細(xì)胞分化，激活 NK細(xì)胞的殺傷毒性；另一方面，能夠促進(jìn)免疫應(yīng)答反應(yīng)，使胎盤細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時能促使滋養(yǎng)細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)，損傷滋養(yǎng)細(xì)胞的生長發(fā)育[13,14]。

本研究結(jié)果表明，URSA患者蛻膜組織中IL-12R及IFN-γR的含量明顯高于正常早孕人流組。說明二者的異常表達(dá)可能通過改變蛻膜組織中細(xì)胞因子的作用，進(jìn)一步影響母胎界面免疫耐受及Th1/Th2的平衡，導(dǎo)致流產(chǎn)[15，16]。提示IL-12、IFN-γ可能與URSA的發(fā)病相關(guān)。用ELISA法對分別用補(bǔ)腎活血方聯(lián)合地屈孕酮及單純地屈孕酮治療的兩組URSA患者治療前后外周血中的IL-12、IFN-γ水平進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療后URSA患者外周血中IL-12、IFN-γ水平明顯降低，并且補(bǔ)腎活血方及地屈孕酮聯(lián)合用藥療效明顯優(yōu)于單純地屈孕酮組，為補(bǔ)腎活血治療URSA臨床應(yīng)用提供了參考依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)檢測蛻膜組織IFN-γR和IL-12R mRNA表達(dá)水平,今后我們的研究方向應(yīng)增加檢測治療前外周血中IL-12與IFN-γ水平的臨床部分，并分析細(xì)胞因子與蛻膜組織靶細(xì)胞膜表面相關(guān)受體作用的相關(guān)性。同時擴(kuò)大樣本量，減少地域因素帶來的影響，以達(dá)到減少誤差的效果，并進(jìn)行多因素分析，設(shè)計相關(guān)的動物實(shí)驗(yàn)，深入研究蛻膜組織中的IL-12、IFN-γ水平及導(dǎo)致URSA的機(jī)制，彌補(bǔ)不足。對患者進(jìn)行遠(yuǎn)期隨訪，完善兒童智力、生長發(fā)育狀況等方面的資料，為補(bǔ)腎活血方長期廣泛應(yīng)用于臨床治療URSA提供依據(jù)。