羅 玉 左 麗 來 濤 張 妮 周恩正 陳俊豪

(貴州醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室,貴陽 550025)

登革病毒(Dengue virus，DENV)直徑40～60 nm，是單股正鏈RNA病毒，長度約11 kb，屬于黃病毒科黃病毒屬，是一種在熱帶和亞熱帶地區(qū)由埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播的常見的蟲媒病毒[1-3]。在過去二十年間，全球每年大約有39億人感染DENV，其中大約10億人產(chǎn)生癥狀，DENV感染可引起自限性的登革熱(Dengue fever，DF)、重癥登革熱出血(Dengue hemorrhagic fever，DHF)和登革休克綜合征(Dengue shock syndrome，DSS)，重癥DF疾病的典型臨床表現(xiàn)為血管滲漏、血小板減少癥和輕度至中度的肝損傷，體液流失過多導(dǎo)致血液濃縮和低血壓，進而引起死亡[4]。DENV感染所導(dǎo)致的死亡率、發(fā)病率和經(jīng)濟負擔(dān)已經(jīng)成為全球公共衛(wèi)生的重要威脅，重要的是這些癥狀的出現(xiàn)與血管內(nèi)皮細胞的功能紊亂有一定關(guān)系[5]。

根據(jù)已知報道，DENV有4種血清型(DENV-1～4)。DENV基因可編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白(E、PrM、C)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)，其中NS1是一種48 kD的糖蛋白，表達在細胞表面并且可以分泌進入DF患者血液[6,7]。另外，DENV NS1蛋白也涉及增加血管內(nèi)皮細胞的滲透[8]。而與血管內(nèi)皮細胞功能障礙相關(guān)的免疫應(yīng)答不適引起的血漿滲漏是重癥DF的病理生理特征,并且內(nèi)皮細胞的激活、炎性介質(zhì)釋放對血管的滲透和細胞與細胞、細胞與基質(zhì)間的黏附有一定關(guān)系[9]。

DENV主要是在人固有免疫細胞中復(fù)制，巨噬細胞是DENV致病機制中的重要靶細胞[6]，其釋放趨化因子和細胞因子，并認為可激活內(nèi)皮細胞誘導(dǎo)血管通透性，并且巨噬細胞在病毒繼發(fā)感染期間起著重要作用[10]。

細胞黏附分子在免疫調(diào)節(jié)和炎性反應(yīng)中起著重要的作用，黏附分子主要涉及白細胞的轉(zhuǎn)運并與其內(nèi)皮細胞上的受體相互作用，在免疫系統(tǒng)中促進細胞黏附[11]。一般認為細胞間黏附分子(Intercellular adhesion molecule,ICAM)-1、血管黏附分子(Vascular adhesion molecule,VCAM)-1、內(nèi)皮選擇素(Endothelium selectin,E-selectin)在慢性炎癥中起著重要作用，并認為是內(nèi)皮細胞紊亂的標(biāo)志[12]。本研究通過建立DENV-2感染HUVECs和人巨噬細胞的共培養(yǎng)體系，來探究其對黏附分子表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 DENV-2標(biāo)準(zhǔn)株(NGC株)由本課題組保存。白紋伊蚊細胞C6/36細胞株購自中科院昆明細胞庫。人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Primary human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)購自美國Sciencell公司。

1.1.2濃縮白細胞濾盤血 經(jīng)貴州省衛(wèi)生和計劃生育委員會和貴州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會同意，由貴州省血液中心提供。

1.1.3試劑和儀器 ECM培養(yǎng)基(含ECGs)(美國Sciencell公司)；人淋巴細胞分離液和紅細胞裂解液(北京Solarbio公司)；RPMI1640 培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)(BI公司)；巨噬細胞集落刺激因子(Macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)(美國PeproTech公司)；EasyPure RNA 提取試劑盒(北京全式金公司)；Anti-Human CD11b APC(Invitrogen公司)；Anti-human CD14 FITC(美國BD公司)；Human sICAM-1、sVCAM-1和sE-selectin Platinum ELISA試劑盒(Invitrogen公司)；倒置顯微鏡(Nikon)；RT system (Bio-Rad，CFX96)；實時熒光定量PCR儀(ABI-STEPONE PLUS)。

1.1.4基因引物序列 各基因堿基序列由上海生工合成，見表1。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) C6/36細胞用RPMI1640 培養(yǎng)基(含10%FBS)，于28℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞生長融合至90%時用胰酶消化傳代；HUVECs細胞用ECM培養(yǎng)基(含10%FBS、1%ECGS)于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞生長融合至約90%時用胰酶消化傳代。

1.2.2DENV-2的鑒定與毒力檢測 用稀釋度10-8～10-1的DENV-2病毒液感染C6/36細胞2 h,PBS潤洗3次，用RPMI1640(含2%FBS)繼續(xù)培養(yǎng)3～6 d，觀察細胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect,CPE)計算DENV-2對C6/36 細胞的組織培養(yǎng)半數(shù)感染量(50% tissue culture infective dose,TCID50)。C6/36細胞生長至90%時，用103TCID50 DENV-2病毒液感染細胞2 h后，PBS潤洗3次，換RPMI1640(含2%FBS)繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d，待細胞出現(xiàn)病變，收集細胞提取RNA，PCR擴增NS1部分序列，1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定目標(biāo)條帶。

表1 相關(guān)基因引物序列

Tab.1 Primer sequence of related gene

GenePrimer(5′ to 3′)Length(bp)NS1F:AACCTATTGATGGTCCCGAAA413R:CCAAGATGGATTTGATTTCTGCTTANS1(q-PCR)F:AACAACTACTGCCTCTGGAAAACTC90R:CATCCGTCCTCACCTCTGTATCTICAM-1F:CAGTGA CCATCTACA GCTTTCCGG119R:GCTGCTACCACAGTGATGACAAVCAM-1F:GATACAACCGTCTTGGTCAGCCC89R:CGCATCCTTCAACTGGGCCTTE-selectinF:TGGAACACAACCTGTACATTTG85R:AATTCCCAGATGAGGTACACTGβ-actinF:GCATGGGTCAGAAGGATTCCT106R:TCGTCCCAGTTGGTGACGAT

1.2.3單核細胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的提取與轉(zhuǎn)化 將用生理鹽水稀釋的濃縮白細胞濾盤血液緩慢加至淋巴細胞分離液表面，通過水平密度梯度離心(2 000 r/min，20 min，室溫)分離提取白膜層，紅細胞裂解液處理5～7 min后，用含2%FBS的PBS潤洗3次，離心(1 500 r/min，7 min，室溫)棄液后所得細胞沉淀即為PBMC，用RPMI1640培養(yǎng)基(含1%FBS)重懸后貼壁2 h，棄去上清，換含10%FBS 的RPMI1640培養(yǎng)基，加終濃度為1 ng/ml M-CSF，培養(yǎng)5～7 d。

1.2.4巨噬細胞的鑒定 棄上清，PBS潤洗3次，胰酶消化細胞后轉(zhuǎn)移至流式管中，300 μl PBS重懸細胞，加20 μl anti-human CD14 FITC和5 μl anti-human CD11b APC，室溫避光染色1 h上機。

1.2.5共培養(yǎng)體系的建立 取對數(shù)期生長的細胞HUVECs接種于Transwell 6孔板的下室，3×105個/孔，培養(yǎng)48 h；將巨噬細胞接種于上室，3×106個/孔，用 RPMI1640培養(yǎng)基(含1%FBS)貼壁2 h；加入103TCID50 DENV-2的病毒液為實驗組，無病毒液為對照組，孵育2 h，PBS潤洗3次，換含10%FBS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.6qRT-PCR 分別于4、8、12、24、48、72 h時間點收集細胞，EasyPure RNA Kit試劑盒提取細胞RNA，檢測RNA純度和濃度后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，β-actin作內(nèi)參，通過SYBR Green染料法檢測目的基因DENV-2 NS1、ICAM-1、VCAM-1、E-selectin的相對表達量。

1.2.7雙抗體夾心ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中ICAM-1、VCAM-1、E-selectin的動態(tài)變化 分別收集各時間點各組培養(yǎng)上清液，并將空白組和等比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品移至ELISA板，100 μl/孔，加入Conjugate液,50 μl/孔，室溫避光1～2 h,棄液拍干，Wash Buffer潤洗3次后棄液拍干，加入100 μl/孔TMB底物顯色液，室溫避光15 min，迅速加入100 μl/孔終止液于450 nm波長檢測吸光度。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 用GraphPad Prism7.0軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析，統(tǒng)計方法采用兩因素方差分析和獨立樣本t檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1DENV-2的鑒定與毒力檢測 DENV-2感染C6/36細胞3～6 d內(nèi)，細胞出現(xiàn)腫脹、融合、空泡、網(wǎng)絡(luò)狀的典型細胞病變。通過RT-PCR擴增DENV-2 NS1部分基因序列，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳于 250～500 bp之間出現(xiàn)一明亮條帶(圖1)，與預(yù)期相符，證實為DENV-2。記錄細胞病變孔數(shù)，根據(jù)Reed-Muench法計算DENV-2的滴度為10-5.5/0.1 ml。

圖1 DENV-2部分序列擴增Fig.1 Partial sequence amplification of NS1Note: 1.Marker;2.PCR production of DENV-2.

2.2巨噬細胞的鑒定 提取并分離PBMC，核細胞經(jīng)刺激因子衍生為巨噬細胞，經(jīng)流式細胞儀鑒定純度為(92.15±1.24)%(圖2)。

2.3qRT-PCR檢測不同時間點HUVECs和巨噬細胞及共培養(yǎng)后HUVECs 中病毒載量 DENV-2感染HUVECs后，NS1 mRNA相對表達量呈先增加后降低趨勢(圖3A)，24 h(1.25±0.16)達峰值且比4 h感染組增加了(1.44±0.17)倍(P<0.05)。DENV-2感染巨噬細胞后，NS1 mRNA相對表達量呈先遞減后增加趨勢(圖3B)。感染的HUVECs與感染的巨噬細胞共培養(yǎng)，其HUVECs的NS1 mRNA相對表達量均高于相應(yīng)時間點HUVECs單獨感染組，在24 h(19.78±2.63,P<0.000 1)、48 h(10.67±0.65,P<0.000 1)顯著上調(diào)(圖4)。

2.4qRT-PCR 檢測不同時間點DENV-2感染的巨噬細胞中ICAM-1、VCAM-1和E-selectin mRNA相對表達量 DENV-2感染巨噬細胞后，ICAM-1 mRNA相對表達量于4 h(2.09±0.01，P<0.000 1)、8 h(2.04±0.01，P<0.000 1)高于巨噬細胞未感染組，12 h(0.92±0.03)、24 h(1.03±0.01)、48 h(0.97±0.04)、72 h(0.84±0.06)相對表達水平與未感染組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖5A)，E-selectin mRNA相對表達量于4 h(5.65±1.51，P<0.000 1)明顯高于未感染組，8 h(1.45±0.21)與未感染組相比表達量相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，12 h(0.15±0.03)、24 h(0.14±0.04)、48 h(0.19±0.06)、72 h(0.24±0.09)與未感染組相比表達量下調(diào)(圖5B)，但未檢測到VCAM-1 mRNA的表達。

圖2 流式細胞術(shù)檢測M-CSF刺激后巨噬細胞的比例Fig.2 Flow cytometry to detect proportion of macroph-ages induced by M-CSFNote: A.Unstained cells;B.Stained cells.

圖3 NS1 mRNA不同時間點相對表達量Fig.3 NS1 mRNA relative expression in HUVECs and macrophages at different timeNote: A.NS1 mRNA in HUVECs；B.NS1 mRNA in macrophages.Compared with uninfected group at the corresponding time,#.P<0.05,##.P<0.01，###.P<0.001，####.P<0.000 1；compared with infected group of 4 h，**.P<0.01，****.P<0.001.

2.5qRT-PCR 檢測不同時間點HUVECs中ICAM-1、VCAM-1和E-selectin mRNA相對表達量 DENV-2感染HUVECs后，各時間點ICAM-1、VCAM-1 mRNA均有表達，共培養(yǎng)組在8 h后表達量相比HUVECs單獨感染組上調(diào)，且均在24 h達峰值，分別為(6.60±0.20，P<0.000 1，圖6A)、(2.48±0.18，P<0.000 1，圖6B)。DENV-2感染HUVECs后， 4 h(1.20±0.08)E-selectin mRNA表達量最高，共培養(yǎng)組呈先增加后遞減趨勢且表達均上調(diào)(圖6C)。

圖4 HUVECs中DENV-2 NS1 mRNA不同時間點相對表達量Fig.4 DENV-2 NS1 mRNA relative expression in HUVECsNote: Compared with infected-HUVECs at the corresponding time,****.P<0.000 1.

圖5 DENV-2感染的巨噬細胞中ICAM-1和E-selectin mRNA相對表達量Fig.5 ICAM-1 and E-selectin mRNA relative expression in DENV-2-infected macrophagesNote: A.ICAM-1 mRNA in macrophages，B.E-selectin mRNA in macrophages.Compared with uninfected group at the corresponding time,####.P<0.000 1.

2.6雙抗體夾心ELISA法檢測HUVECs中黏附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin 在不同時間點的動態(tài)變化 DENV-2感染的HUVECs與未感染的HUVECs組相比，在相同時間點表達的ICAM-1水平均無明顯變化，共培養(yǎng)組中感染DENV-2的HUVECS表達ICAM-1水平在8 h(91.63±0.57)最高，未被感染的HUVECs表達ICAM-1水平呈先增加后減少趨勢，在24 h(92.85±0.24)達峰值(圖7A)。DENV-2感染的HUVECs組，其表達E-selectin水平隨時間呈逐漸遞增，且在72 h(6.07±0.39，P<0.000 1)表達量最高；共培養(yǎng)組中感染DENV-2的HUVECs，其表達E-selectin水平隨時間呈先遞增后降低趨勢，且在24 h(6.12±1.03，P<0.000 1)表達量達峰值(圖7B)。但未檢測到各組培養(yǎng)上清液中VCAM-1分子的表達。

圖6 HUVECs中ICAM-1、VCAM-1和E-selectin mRNA不同時間點相對表達量Fig.6 ICAM-1，VCAM-1 and E-selectin mRNA relative expression in HUVECsNote: Compared with infected-HUVECs at the corresponding time,*.P<0.05，***.P<0.001,****.P<0.000 1.

圖7 雙抗體夾心ELISA法檢測HUVECs表達ICAM-1和E-selectin的動態(tài)變化Fig.7 ELISA to detect expression of ICAM-1 and E-selectin in HUVECsNote: H.HUVECs；DV.DENV-2；C-H.co-cultured HUVECs;DV-infected HUVECs compared with uninfected HUVECs，*.P<0.000 1;DV-infected HUVECs compared with uninfected HUVECs in co-cultured group.#.P<0.000 1.

3 討論

DENV感染后引起DHF和DSS的病理機制尚不完全清楚，但內(nèi)皮細胞通常作為研究DENV致病機制的重要細胞。DHF的典型癥狀表現(xiàn)為血管滲透，有研究表明許多炎癥因子和血管生成介質(zhì)增加血管蛋白對小靜脈和毛細血管內(nèi)皮的滲透作用[13]。據(jù)報道，細胞因子在DHF的發(fā)病機制中起重要作用，其患者的血管滲透與血漿中各種細胞因子的水平升高有關(guān)[8]。然而，一般而言，組織的損傷程度與病情嚴(yán)重程度并不十分一致[14]，另外，短暫性的血漿滲漏和DSS兒童患者的快速恢復(fù)都表明滲透性的改變受可溶性介質(zhì)的影響[15]。

在PBMC的存在下，內(nèi)皮細胞的滲透性增加，其滲透性增加可能部分原因是由于DENV感染PBMC時產(chǎn)生細胞因子[16]，DENV可在單核細胞衍生的巨噬細胞和單核細胞樣細胞系中復(fù)制并誘導(dǎo)細胞因子和細胞毒性因子。有研究報道，在體外，DENV感染的PBMC能激活內(nèi)皮細胞并介導(dǎo)黏附分子的釋放，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞的滲透性增加[17]。在本次實驗中，DENV-2感染HUVECs和人巨噬細胞，在不同時間點均能檢測到NS1 mRNA表達，在24 h其相對表達量達峰值，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且被DENV-2感染的HUVECs在各時間點均有黏附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin mRNA的表達。而細胞黏附因子是一類能夠介導(dǎo)免疫細胞和細胞因子與血管內(nèi)皮細胞等相互作用的糖蛋白，作為黏附分子家族成員之一的E-selectin可以介導(dǎo)白細胞向內(nèi)皮細胞的滾動和黏附，而牢固的黏附和向內(nèi)皮下組織的遷移由免疫球蛋白超家族成員，包括ICAM-1和VCAM-1的參與[18]。本研究中，DENV-2感染的巨噬細胞，在4、8 h 其ICAM-1和E-selectin mRNA相對表達量明顯高于未感染組，但未檢測到VCAM-1 的表達，說明DENV-2能夠激活巨噬細胞，但不能有效地刺激VCAM-1的表達。另外，將感染DENV-2的巨噬細胞添加到感染DENV-2的HUVECs中，內(nèi)皮細胞中病毒RNA拷貝數(shù)在24 h和48 h明顯增加，這可能與DENV-2感染活化的巨噬細胞促炎作用有關(guān)，這些巨噬細胞是由單核細胞衍生而來。且在共培養(yǎng)組中檢測到12 h后，DENV-2感染的HUVECs中ICAM-1、VCAM-1和E-selectin mRNA相對表達量均明顯高于單獨感染的HUVECs，在各時間點均能檢測到培養(yǎng)上清液中可溶性分子ICAM-1和E-selectin的表達，說明DENV-2感染的巨噬細胞可能增強DENV-2感染的HUVECs的細胞活化，使內(nèi)皮細胞表達的黏附分子維持在較高水平，從而引起白細胞與血管內(nèi)皮細胞間黏附的改變，促進血管內(nèi)皮細胞局部炎癥的發(fā)生，導(dǎo)致血管的屏障功能受損，從而促進血管滲漏的發(fā)生。

本次研究證明在DENV-2感染的巨噬細胞與HUVECs的共培養(yǎng)體系下，活化的巨噬細胞在一定時效內(nèi)能增強DENV-2在內(nèi)皮細胞中的復(fù)制作用并促進細胞黏附分子的表達。部分報道認為是單核細胞能導(dǎo)致DENV感染的內(nèi)皮細胞鈣黏蛋白表達減少，黏附分子表達增加，細胞間出現(xiàn)多個間隙，導(dǎo)致滲漏增加[19,20]，但目前對于DENV-2感染后，內(nèi)皮細胞與巨噬細胞相互作用對黏附分子的影響了解更少，本研究為今后繼續(xù)探討DENV感染的免疫病理機制提供一定的基礎(chǔ)。