蔣永升，沈洋，楊敏威，陶泠燁，何睿哲，孫勇偉

（上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院 膽胰外科，上海 200127）

據(jù)相關報道，在其他腫瘤預后顯著提高的背景下，從1971年至2011年這四十年間胰腺癌患者的預后卻幾乎沒有任何改善[1-4]。多種生物學特征造成了這一結果，有氧糖酵解在其中最為突出。相較于氧化磷酸化過程，腫瘤更傾向于利用糖酵解的方式獲取能量，即有氧糖酵解[5]，也被稱為瓦伯格效應（Warburg effect）[6]。根據(jù)Bailey、Collisson基于表達譜水平提出的胰腺癌分型標準[7]，預后最差的準間質(zhì)亞組（quasimesenchymal subtype）也表現(xiàn)出顯著增強的糖酵解活動[8]。因此，近年來大量的研究聚焦于細胞糖酵解對胰腺癌發(fā)生發(fā)展的作用，認為腫瘤細胞糖酵解處于癌癥發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)，也指出針對腫瘤細胞糖代謝異常的治療方法可能是胰腺癌治療的關鍵[9-12]。

本研究中，我們旨在尋找影響胰腺癌有氧糖酵解的新分子機制，增加對胰腺癌的認識與了解，進而發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點。G蛋白偶聯(lián)受體（G-proteincoupled receptors，GPCRs）是人體內(nèi)最大的跨膜受體家族，在細胞信號傳遞中發(fā)揮著重要的作用[13]。近年來針對G蛋白偶聯(lián)受體C型家族5A基因（GPRC5A）的研究發(fā)現(xiàn)，其對腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲等細胞功能均存在影響，并且在結腸癌、乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤中均存在異常高表達[14]，但針對其在胰腺癌中的研究卻鮮有報道，因而本研究擬分析GPRC5A在胰腺癌臨床樣本中的表達情況及其對胰腺癌細胞有氧糖酵解的影響。

1 材料和方法

1.1 表達譜芯片組織樣本

本課題中所用建立表達譜芯片的原始樣本為50對上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院膽胰外科2012年1月至2013年12月期間手術治療并通過術后病理確診的胰腺癌患者的胰腺癌組織與癌旁組織。本表達譜芯片所有患者組織及臨床資料的收集與使用均通過上海交通大學附屬仁濟醫(yī)院倫理審查委員會的審核與批準。

1.2 生物信息學分析資料

本課題所用的TCGA數(shù)據(jù)庫中的胰腺導管腺癌的mRNA測序數(shù)據(jù)下載自TCGA數(shù)據(jù)庫，GTEx正常胰腺mRNA測序數(shù)據(jù)下載自GTEx數(shù)據(jù)庫，GSE16515和GSE28735的mRNA數(shù)據(jù)下載于GEO數(shù)據(jù)庫?；蚋患治鼋Y果通過GSEA軟件分析Hallmarks數(shù)據(jù)集所得。

1.3 胰腺癌細胞系的復蘇培養(yǎng)與干擾GPRC5A表達

本研究所用細胞均購自上海中科院，在含有10% FBS（美國Gibco公司）和雙抗的1640培養(yǎng)基（上海源培生物科技有限公司）或DMEM培養(yǎng)基（上海源培生物科技有限公司）中培養(yǎng)，孵育箱設置條件為37 ℃、5% CO2。

進行小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染前，將對數(shù)生長期胰腺癌細胞轉(zhuǎn)入6孔板培養(yǎng)，每孔細胞生長至60%左右，換液，將siRNA（上海吉瑪制藥技術有限公司）與Lipofectamine 2000（賽默飛公司）混勻加入配液中，6～8 h后換液，轉(zhuǎn)染48 h后檢測干擾效率。干擾序列：siGPRC5A-1：5’-AGGCAGCAUUUUUCGCC UGTT-3’；siGPRC5A-2：5’-GCTTATGTTAGTCCCG AGTTT-3'。

1.4 細胞總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、Real-time PCR檢測

步驟參考文獻[15]。

1.5 Seahorse糖酵解能力測定

為測定細胞的代謝方式與代謝強度，我們利用XF 96 Seahorse分析儀檢測細胞的細胞外酸化程度（ECAR），以5 000～20 000/孔的密度將細胞種到XF96孔板中，在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育過夜，使細胞貼壁，為測定ECAR值，順次向培養(yǎng)皿中加入葡萄糖、寡霉素和2-DG，待機器讀數(shù)完成后分析數(shù)據(jù)結果。詳細操作過程參考文獻[15]。

1.6 統(tǒng)計學分析

利用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較使用t檢驗或者卡方分析，Kaplan-Meier法進行預后分析。P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 GPRC5A的篩選過程

為了篩選出胰腺癌中與糖酵解相關性高的癌基因，我們設定篩選條件：（1）在課題組50對表達譜芯片（仁濟表達譜芯片）中癌與癌旁組織具有統(tǒng)計學差異性表達（P＜1×10-5）；（2）在仁濟表達譜芯片數(shù)據(jù)中與糖酵解相關基因的相關性排名前10%；（3）在The Cancer Genome Atlas（TCGA）胰腺癌數(shù)據(jù)庫中與糖酵解相關基因的相關性排名前10%；（4）屬于Collisson的胰腺癌分型中預后最差的一組——準間質(zhì)亞組（quasimesenchymal subtype）的標志性基因[7]。經(jīng)過篩選，我們最終得到包括GPRC5A在內(nèi)的七個基因（GPRC5A、HMMR、SLC5A3、SLC16A1、TWIST1、PMAIP1、NT5E），其中并未發(fā)現(xiàn)關于GPRC5A在胰腺癌有氧糖酵解影響的報道，因此，本研究中我們選取GPRC5A做進一步的研究與機制探討（圖1A）。

2.2 GPRC5A在臨床數(shù)據(jù)庫中的表達情況

我們首先從Gene Expression Omnibus（GEO）公共數(shù)據(jù)庫中下載了GSE15471、GSE16515、GSE28735三個公共數(shù)據(jù)集并結合課題組50對表達譜芯片數(shù)據(jù)，并分別在三個數(shù)據(jù)庫中比較了腫瘤與癌旁組織中GPRC5A的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)，GPRC5AmRNA在腫瘤組織中的表達水平均高于癌旁組織（GSE15471，P＜0.0001；GSE16515，P=0.0157；GSE28735，P＜0.0001） （圖1B）。我們接著比較了GPRC5A在TCGA的腫瘤樣本與The Genotype-Tissue Expression（GTEx）中的正常樣本中的表達情況，結果同樣顯示GPRC5A在腫瘤樣本中表達量更高（圖1C） （P=0.0311），為判斷GPRC5A表達量對胰腺癌預后的影響，我們將179例TCGA胰腺癌標本根據(jù)GPRC5A表達量高低分為兩組，并對兩組患者的預后進行了比較，結果顯示高表達GPRC5A的患者無論是總生存期（P=0.0069）還是無進展生存期（P=0.02）均顯著短于GPRC5A低表達組（圖1D），以上結果提示我們GPRC5A在胰腺癌中高表達，其高表達預示著患者具有較差的預后。

2.3 GPRC5A促進胰腺癌細胞的糖酵解

圖1 糖酵解相關基因篩選及GPRC5A的表達與預后分析

由于GPRC5A是通過根據(jù)與糖酵解相關基因的相關性篩選得到的，我們推測其是否通過影響胰腺癌細胞的糖酵解能力進而發(fā)揮了促進腫瘤生長的作用。首先，我們把測序得到的50對表達譜芯片數(shù)據(jù)根據(jù)GPRC5A的表達情況分為高、低表達兩組，并進行了基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），結果提示糖酵解數(shù)據(jù)集在GPRC5A高表達組中存在富集（圖2A）。另外我們還分析了表達譜芯片中GPRC5A同糖酵解關鍵酶的相關性，發(fā)現(xiàn)其與絕大部分的關鍵酶均存在較高的正相關性（圖2B）。我們接下來測定了不同胰腺癌細胞系中GPRC5A的表達情況，并選擇其中表達量較高的AsPC-1和BxPC-3進行后續(xù)的細胞功能實驗（圖2C），通過siRNA在兩個細胞系中對GPRC5A的表達進行干擾并通過實時定量PCR進行效率驗證（圖2D）。隨后，我們通過Seahorse檢測儀檢測了正常與GPRC5A干擾的細胞中細胞外酸化程度（ECAR），結果顯示兩個細胞系中GPRC5A敲低組的ECAR值均顯著低于對照組（圖2E），提示干擾GPRC5A后腫瘤細胞的糖酵解能力出現(xiàn)減弱。

圖2 GPRC5A對胰腺癌細胞糖酵解能力的影響

3 討論

糖酵解作為腫瘤的重要特征之一，在胰腺癌中具有更為重要的意義，原因在于胰腺癌的一個重要特征是其具有豐富的細胞外基質(zhì)成分，這導致腫瘤組織內(nèi)乏氧、乏血供的腫瘤微環(huán)境，在這種條件下腫瘤更加依賴不耗氧的糖酵解獲取能量[16]。通過糖酵解細胞能更快地獲取能量，滿足其對能量的快速需求。另外，腫瘤細胞增殖復制需要大量的核苷酸、氨基酸等生物大分子及前體物質(zhì)，而糖酵解產(chǎn)生的中間產(chǎn)物則能很好地對其合成代謝進行原料的補充，這也是器官發(fā)育過程中干細胞的主要代謝特點。

在本研究中，我們首先通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)了GPRC5A可能對胰腺癌糖酵解過程存在促進作用，一方面，我們利用TCGA、GEO等數(shù)據(jù)庫證實GPRC5A在胰腺癌組織中表達量顯著高于癌旁組織，同時其高表達預示著較差的預后，另外我們也通過GSEA數(shù)據(jù)分析、Seahorse糖酵解實驗證實了我們的猜想。

G蛋白偶聯(lián)受體C型家族5A（GPRC5A）屬于人體內(nèi)最大的蛋白超家族G蛋白偶聯(lián)受體，包含有超過700個基因，這一家族在多種生物學過程中均發(fā)揮了重要的功能，也經(jīng)常被利用為藥物作用靶點。G蛋白偶聯(lián)受體在腫瘤進展中也發(fā)揮了不可或缺的作用，因此進一步研究這一家族在胰腺癌中的作用具有重要意義，GPRC5A基因在在多種腫瘤中均有報道，但其發(fā)揮的功能不盡相同，在乳腺癌中GPRC5A高表達可以促進腫瘤細胞的增殖[17]，而在肺腺癌中GPRC5A則被認為是抑癌基因，在GPRC5A敲除的小鼠中有76%的小鼠出現(xiàn)了肺腺瘤，17%的小鼠出現(xiàn)了肺腺癌[18]。

綜上所述，在本次研究中我們揭示了GPRC5A在胰腺癌中對糖酵解的促進作用，存在著作為治療靶點的潛力，但其發(fā)揮功能的具體機制還有待進一步闡明。