潘新平 劉小敏 田立

(定西市人民醫(yī)院 1腫瘤內(nèi)科，甘肅 定西 743000；2手術(shù)室)

惡性腫瘤受多個(gè)癌基因、抑癌基因的調(diào)控，明確這些基因在腫瘤發(fā)生中的作用是闡明腫瘤發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵。結(jié)直腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，具有早期臨床癥狀不明顯、惡性程度高、發(fā)展速度快等特點(diǎn)，研究結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制具有重要意義〔1〕。PHLPP1在人體的組織和器官中廣泛表達(dá)，是目前發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，具有抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，其在卵巢癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤組織中低表達(dá)，在乳腺癌等腫瘤細(xì)胞中已經(jīng)證實(shí)PHLPP1具有抑制腫瘤細(xì)胞生長作用，而在結(jié)直腸癌細(xì)胞生長中的作用尚不明確〔2～5〕。本實(shí)驗(yàn)首先檢測PHLPP1在結(jié)直腸癌和正常結(jié)腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建上調(diào)PHLPP1的細(xì)胞株，探討PHLPP1高表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 pcDNA3.1-PHLPP1由甘肅金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)研究所構(gòu)建保存；Lipofectmine2000轉(zhuǎn)染試劑、RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司；cDNA合成相關(guān)試劑購自立陶宛MBI Fermentas公司；熒光定量PCR試劑盒購自美國Thermo公司；ECL顯色試劑盒購自生工生物工程上海(股份)有限公司；活化型Caspase-9抗體、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體購自美國Abnova公司；活化型Caspase-3抗體、細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(Cdk)4抗體購自美國Santa Cruz公司；PHLPP1抗體購自美國Merck millipore公司。

1.2細(xì)胞株 結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29、Lovo、SW480和人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC購自美國ATCC，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)溫度為37℃，CO2濃度為5%，期間每隔2～3 d進(jìn)行細(xì)胞傳代，用0.25%的胰蛋白酶消化。

1.3熒光定量PCR測定PHLPP1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá) 結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29、Lovo、SW480和人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC按照RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中的總RNA，RNA用適量的DEPC水溶解以后，保存于-80℃。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，體系為：2 μg總RNA、2 μl隨機(jī)引物、1 μl dNTP加水至12 μl，放在65℃孵育5 min后，置于冰上冷卻。再添加4 μl 反應(yīng)緩沖液、2 μl的DTT、1 μl的RNase，置于37℃孵育2 min后，置于冰上。加入M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μl，混合后，25℃ 10 min，37℃ 50 min，70℃ 15 min，產(chǎn)物保存在-20℃。取cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)孔，40次循環(huán)，內(nèi)參為GAPDH，步驟同熒光定量PCR試劑盒，測定反應(yīng)管熒光強(qiáng)度到達(dá)閾值時(shí)的Ct值，用2-△△Ct法計(jì)算待測基因PHLPP1的表達(dá)水平。

1.4Western印跡測定PHLPP1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá) 結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29、Lovo、SW480和人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC用含有PMSF的蛋白裂解液裂解以后，在4℃離心10 min，把上清吸取至離心管中，常規(guī)BCA法對蛋白進(jìn)行定量。按照每個(gè)泳道中添加20 μg蛋白進(jìn)行上樣，蛋白凝膠用10%的分離膠，蛋白電泳用100 V恒壓，觀察染料進(jìn)入底部邊緣，終止電泳。準(zhǔn)備大小合適的PVDF膜，浸泡至轉(zhuǎn)膜緩沖液中10 min以后，常規(guī)方法將凝膠上的蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜，轉(zhuǎn)膜在4℃中進(jìn)行，轉(zhuǎn)膜電壓為90 V。PVDF膜與待測蛋白抗體(PHLPP1抗體1∶200稀釋)室溫孵育1 h以后，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶3 000稀釋)室溫孵育2 h。滴加ECL顯色液。分析PHLPP1蛋白和內(nèi)參GAPDH的灰度值，以二者的比值表示PHLPP1蛋白水平。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染 Lovo細(xì)胞按照每個(gè)孔加入105個(gè)細(xì)胞種植到6孔板，細(xì)胞密度為80%，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞培養(yǎng)液更換成為不含血清的培養(yǎng)液，用Lipofectmine2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，步驟同Lipofectmine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，把pcDNA3.1-PHLPP1和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后24 h，將細(xì)胞按照1∶3的比例進(jìn)行傳代以后，以500 μg/ml的G418篩選，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PHLPP1和pcDNA3.1的細(xì)胞記為PHLPP1組和NC組，把沒有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為Control組。用熒光定量PCR和Western印跡方法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中PHLPP1表達(dá)變化，步驟同上。

1.6細(xì)胞增殖檢測 以MTT法檢測各組細(xì)胞增殖情況。取Control、NC、PHLPP1細(xì)胞，以0.25%的胰蛋白酶消化以后，用細(xì)胞培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞密度為5×104個(gè)/ml，每個(gè)孔中加入100 μl的細(xì)胞懸液，將各組細(xì)胞接種到96孔板內(nèi)，分別在培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d時(shí)各取出一個(gè)培養(yǎng)板，每孔添加20 μl的MTT，孵育4 h。棄上清，加150 μl的DMSO，用空白孔調(diào)零后，檢測492 nm的A值。

1.7細(xì)胞周期檢測 以PI單染法流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期變化。取Control、NC、PHLPP1細(xì)胞，以0.25%的胰蛋白酶消化以后，收集106個(gè)細(xì)胞，用冰預(yù)冷的PBS洗滌2次，1 200 r/min離心10 min后，將PBS徹底吸除，以75%的乙醇懸浮細(xì)胞后，加入5 μl的PI染液，于避光條件孵育結(jié)合20 min。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化。同時(shí)收集各組細(xì)胞，用Western印跡方法檢測細(xì)胞中周期蛋白CyclinD1、Cdk4的表達(dá)水平，步驟同上。

1.8細(xì)胞凋亡檢測 以雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況。取Control、NC、PHLPP1細(xì)胞，以0.25%的胰蛋白酶消化以后，每組細(xì)胞收集106個(gè)，添加1 ml的預(yù)冷的PBS，震蕩混合后，1 000 r/min離心10 min。用200 μl的上樣緩沖液將細(xì)胞懸浮以后，加入10 μl的Annexin V-FITC和PI，輕搖混合后，避光反應(yīng)15 min。添加300 μl的上樣緩沖液，以流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。同時(shí)收集各組細(xì)胞，用Western印跡方法檢測細(xì)胞中凋亡蛋白活化型Caspase-3、活化型Caspase-9的表達(dá)水平，步驟同上。

1.9統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1PHLPP1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平低于人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞 結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29、Lovo、SW480中PHLPP1 mRNA和蛋白水平均顯著低于人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC(P<0.05)。PHLPP1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中低表達(dá)。見圖1和表1。

圖1 Western印跡檢測PHLPP1在各細(xì)胞中的表達(dá)

細(xì)胞PHLPP1 mRNAPHLPP1蛋白FHC1.00±0.000.78±0.09Lovo0.25±0.031)0.21±0.031)HT290.30±0.021)2)0.26±0.011)3)SW4800.48±0.061)2)3)0.32±0.031)2)3)

與FHC比較：1)P<0.05；與Lovo比較：2)P<0.05；與HT29比較：3)P<0.05

2.2pcDNA3.1-PHLPP1上調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞中PHLPP1表達(dá)水平 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PHLPP1的結(jié)直腸癌細(xì)胞中PHLPP1的表達(dá)水平高于未做轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染對照載體pcDNA3.1的細(xì)胞(P<0.05)。成功構(gòu)建了高表達(dá)PHLPP1的結(jié)直腸癌細(xì)胞株，見圖2和表2。

圖2 Western印跡檢測轉(zhuǎn)染以后結(jié)直腸癌細(xì)胞中PHLPP1表達(dá)水平

2.3PHLPP1降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖活性 高表達(dá)PHLPP1的結(jié)直腸癌細(xì)胞在培養(yǎng)后1 d、2 d、3 d、4 d各時(shí)間點(diǎn)的增殖活性均明顯低于未做轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染對照載體pcDNA3.1的細(xì)胞(P<0.05)，表明PHLPP1抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖活性，見表3。

表2 轉(zhuǎn)染以后結(jié)直腸癌細(xì)胞中PHLPP1表達(dá)水平比較

與PHLPP1組比較：1)P<0.05；下表同

表3 各組結(jié)直腸癌細(xì)胞在培養(yǎng)后不同時(shí)間點(diǎn)A值比較

2.4PHLPP1阻滯結(jié)直腸癌細(xì)胞周期并下調(diào)CyclinD1、Cdk4蛋白表達(dá)水平 高表達(dá)PHLPP1的結(jié)直腸癌細(xì)胞G1期細(xì)胞比例均明顯高于未做轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染對照載體pcDNA3.1的細(xì)胞(P<0.05)。同時(shí)高表達(dá)PHLPP1后的結(jié)直腸癌細(xì)胞中CyclinD1、Cdk4蛋白水平降低，表明PHLPP1阻滯結(jié)直腸癌細(xì)胞周期，并下調(diào)周期蛋白CyclinD1、Cdk4的表達(dá)，見圖3和表4。

圖3 Western印跡檢測PHLPP1對結(jié)直腸癌細(xì)胞中周期蛋白CyclinD1、Cdk4表達(dá)影響

表4 各組結(jié)直腸癌細(xì)胞周期分布及CyclinD1、Cdk4表達(dá)水平比較

2.5PHLPP1誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)細(xì)胞中活化型Caspase-3、活化型Caspase-9表達(dá) 高表達(dá)PHLPP1的結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡率均明顯高于未做轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染對照載體pcDNA3.1的細(xì)胞(P<0.05)，表明同時(shí)高表達(dá)PHLPP1后的結(jié)直腸癌細(xì)胞中活化型Caspase-3、活化型Caspase-9蛋白水平也升高。PHLPP1誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，并且可以誘導(dǎo)凋亡蛋白活化型Caspase-3、活化型Caspase-9的表達(dá)。見圖4和表5。

圖4 PHLPP1誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡

組別凋亡率(%)活化型Caspase-3活化型Caspase-9Control組4.62±0.281)0.20±0.031)0.35±0.041)NC組4.86±0.421)0.21±0.051)0.34±0.031)PHLPP1組22.18±3.200.49±0.080.96±0.12

3 討 論

PHLPP是一種絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，這類磷酸酶具有阻礙細(xì)胞內(nèi)生存信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，在細(xì)胞生長中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，其基因定位于18q21.33染色體上，其編碼的蛋白質(zhì)含有亮氨酸富集區(qū)、pleckstrin同源結(jié)構(gòu)域、PDZ結(jié)構(gòu)域、PP2C結(jié)構(gòu)域，在調(diào)控細(xì)胞生長中具有重要作用〔6～9〕。研究顯示，PHLPP1作為PHLPP的成員之一，在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮抑制作用〔10〕。在結(jié)直腸癌中的研究發(fā)現(xiàn)，PHLPP1表達(dá)下調(diào)與腫瘤的分化程度、臨床病理參數(shù)等具有相關(guān)性〔11〕。在乳腺癌、肺癌、食管癌等中的研究表明，PHLPP1不僅可以在體外抑制癌細(xì)胞的生長，還可以在體內(nèi)下調(diào)癌細(xì)胞裸鼠成瘤能力〔12～14〕。本研究顯示，PHLPP1在三株結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平均明顯低于人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞，并且過表PHLPP1后的結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力明顯降低，這明確了PHLPP1在結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖中的作用。

細(xì)胞周期有兩個(gè)較為關(guān)鍵的檢查點(diǎn)，為G1/S期和G2/M期，這兩個(gè)檢查點(diǎn)在受到相關(guān)因子的調(diào)節(jié)作用后可以順利地進(jìn)入下一個(gè)周期，細(xì)胞周期順利進(jìn)展是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵〔15〕。在哺乳動(dòng)物、酵母等生命體內(nèi)已經(jīng)證實(shí)，G1期決定著細(xì)胞是否可以完成的一個(gè)細(xì)胞周期，G1期是細(xì)胞DNA復(fù)制準(zhǔn)備的關(guān)鍵時(shí)期〔16〕。細(xì)胞周期素是調(diào)控細(xì)胞周期的重要因子，其中CyclinD1在G1期合成水平較高，能夠促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期過渡〔17,18〕。周期素依賴性激酶可以同周期素結(jié)合，其表達(dá)水平的高低隨著細(xì)胞周期進(jìn)展而呈現(xiàn)規(guī)律性的變化，Cdk4在G1期同Cyclin結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展〔19〕。最近的研究顯示，PHLPP1能夠?qū)⒓?xì)胞髓系白血病細(xì)胞周期阻滯在G1期，這可能是其抑制白血病細(xì)胞生長的原因之一〔20〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PHLPP1同樣可以阻礙結(jié)直腸癌細(xì)胞從G1期向S期過渡，并且可以下調(diào)Cdk4、Cyclin D1蛋白的表達(dá)，提示PHLPP1可能通過阻礙細(xì)胞周期進(jìn)展下調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力。

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展除了與腫瘤細(xì)胞惡性增殖有關(guān)以外，還與腫瘤細(xì)胞凋亡減少有關(guān)，腫瘤細(xì)胞的凋亡受到細(xì)胞內(nèi)多種基因的共同調(diào)控作用，其中Caspase凋亡反應(yīng)是細(xì)胞凋亡發(fā)生的主要原因，Caspase-3和Caspase-9作為該凋亡反應(yīng)的執(zhí)行因子和起始因子在凋亡過程中發(fā)揮標(biāo)志性作用〔21～23〕。目前在肺癌、胃癌等腫瘤中發(fā)現(xiàn)，上調(diào)PHLPP1的表達(dá)可以激活細(xì)胞內(nèi)Caspase凋亡反應(yīng)，這可能是PHLPP1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一〔24,25〕。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，上調(diào)PHLPP1后的結(jié)直腸癌細(xì)胞中Caspase-3和Caspase-9活化程度升高，細(xì)胞凋亡率也升高，提示PHLPP1可以激活Caspase凋亡反應(yīng)誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡。