朱 雯 趙 錦

(山東省淄博市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，淄博 255200)

心肌炎是指感染、物理、化學因素或自身免疫病引起的心肌炎癥性病變，病毒性感染是最常見病因[1]。癥狀包括心率不齊、運動能力下降、呼吸急促和胸部疼痛，由于擴張性心肌病和心臟驟停引起心力衰竭[2]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)20多種病毒可引起心肌炎，其中以柯薩奇病毒最為常見[3]。心肌炎的診斷方法包括心電圖、肌鈣蛋白、核磁成像和心臟超聲。目前心肌炎缺少特異的治療措施，以輔助治療和限制體力活動為主，常用的藥物有血管緊張素轉換酶抑制劑、β受體阻滯藥和利尿劑[4,5]。據(jù)統(tǒng)計，2013年全年約有150萬人診斷為急性心肌炎，其中男性患者數(shù)量居多[6]。瑞舒伐他汀是臨床上常用的調(diào)節(jié)血脂的藥物，能選擇性地抑制肝臟中3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methyl glutaric coenzyme A，HMG-COA)還原酶，使低密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯顯著降低，且降脂效果優(yōu)于同類藥物[7]。研究發(fā)現(xiàn)，瑞舒伐他汀具有改善血管內(nèi)皮穩(wěn)定、抗氧化、抗炎性反應和免疫調(diào)節(jié)的作用[8,9]。近來有報道顯示，瑞舒伐他汀具有心肌保護作用，抑制自身免疫引起的心肌炎癥[10]，但瑞舒伐他汀對病毒性心肌炎的影響尚未見報道。本文以病毒性心肌炎小鼠為模型，研究瑞舒伐他汀對病毒性心肌炎的保護作用及相關的機制。

1 材料與方法

1.1材料 BALB/c雄性小鼠，4～6周齡，體重16～18 g，購自廣東醫(yī)學實驗動物中心。瑞舒伐他汀為阿斯利康制藥有限公司產(chǎn)品。HE染色試劑盒、TUNEL染色試劑盒購自碧云天生物；肌紅蛋白(Myoglobin,Mb)、肌酸激酶同工酶(Creatine kinase MB isoenzyme,CK-MB)和肌鈣蛋白1(Cardiac troponin 1,cTn1)和白細胞介素(Interleukin 6,IL-6)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測定試劑盒均購自上海邦奕生物科技有限公司；小鼠TNF-α ELISA測定試劑盒購自艾美捷科技有限公司?？滤_奇B3病毒(Coxsackie virus B3，CVB3)來源于中國科學院昆明病毒所。

1.2方法

1.2.1CVB3病毒擴增和滴度檢測 取對數(shù)生長期的Hela細胞，接種于6孔板，待覆蓋面積達80%以上時，加CVB3病毒原液，繼續(xù)培養(yǎng)2 d。2 000 r/min離心10 min，收集上清液。采用Reed-Muench法做滴度測定，細胞接種于96孔板，病毒懸液用梯度稀釋法稀釋成10-10～10-1噬菌斑形成單位(Plaque forming unit，PFU)后，加病毒懸液至相應細胞孔，設置空白組和對照組，培養(yǎng)72 h后，檢測細胞病變，以50%的病變細胞為判斷標準，計算半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(50% tissue culture infective dose,TCID50)。

1.2.2小鼠分組及模型的建立 將32只BALB/c小鼠隨機分成4組：對照組、瑞舒伐他汀組、CVB3誘導組和CVB3+瑞舒伐他汀組，每組8只。CVB3誘導組和CVB3+瑞舒伐他汀組小鼠腹腔注射 0.5 ml TCID50的CVB3病毒液。瑞舒伐他汀組和CVB3+瑞舒伐他汀組小鼠腹腔注射5 mg/kg BW 的瑞舒伐他汀，每天1次，連續(xù)注射12 d。

1.2.3HE染色 小鼠處死前，真空采血管取血。剪開右心耳，生理鹽水沖洗，多聚甲醛灌注100 ml。乙醇逐級脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染色10 min，自來水洗，鹽酸乙醇分色，水洗返藍，70%乙醇處理5 min，80%乙醇處理5 min，伊紅液染色20 s，95%乙醇5 min，無水乙醇5 min，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.4TUNEL染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，PBS洗5 min，加蛋白酶K室溫下水解20 min；蒸餾水洗，3%過氧化氫室溫下反應5 min，PBS洗2次；加TdT緩沖液，室溫5 min，吸干后加TdT反應液，濕盒中37℃反應1 h；加反應終止液，37℃反應30 min；PBS洗3次，加過氧化物酶標記的抗體，濕盒中室溫孵育30 min；PBS洗3次，加顯色液，室溫反應5 min。蒸餾水洗，脫水，透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察并拍照，用Image-pro plus軟件分析陽性細胞數(shù)目。

1.2.5心臟功能指標檢測 小鼠感染CVB3病毒第12天后，進行心臟功能檢測，術前禁食不禁水4 h。小鼠腹腔注射3%的戊巴比妥鈉溶液麻醉，仰臥位固定。備皮，沿頸部剪開皮膚，分離氣管，插入連接呼吸機的導管。分離右頸總動脈，將微導管經(jīng)右頸總動脈插入升主動脈及左心室。多道生理放大器和記錄儀測量左心室收縮壓峰值，動脈導管記錄平均動脈壓和心率。

1.2.6ELISA測定 將采取的血液樣品于室溫靜置2 h，使血清析出，4℃離心機中2 500 r/min離心10 min后，取上清，生理鹽水稀釋后備用。取100 μl樣品至反應孔，設置標準樣品孔和空白孔，加檢測抗體，37℃孵育90 min，洗滌液洗5次，加生物素標記的辣根過氧化物酶，37℃溫育30 min，洗滌液洗5次；加顯色液，37℃避光反應15 min，加終止液，檢測波長為450 nm處吸收值。每個標本測3個復孔，測定值為3個復孔的平均值。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析，兩組間比較使用t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1瑞舒伐他汀緩解CVB3誘導的小鼠心肌組織損傷 對照組和瑞舒伐他汀組心肌細胞結構正常，排列規(guī)則，橫紋整齊，未見炎癥細胞浸潤(圖1)；CVB3誘導組心外膜充血，心肌組織出現(xiàn)炎癥細胞浸潤，細胞間隙變大，出現(xiàn)空泡(圖1)。CVB3+瑞舒伐他汀組，心肌組織病理損傷明顯減輕(圖1)。表明瑞舒伐他汀可以緩解CVB3誘導的小鼠心肌組織損傷。

2.2瑞舒伐他汀抑制CVB3誘導的小鼠心肌細胞凋亡 TUNEL染色結果顯示，對照組和瑞舒伐他汀組相比，凋亡陽性心肌細胞的比率沒有明顯變化(P>0.05，圖2)。CVB3誘導組與對照組相比，凋亡細胞的比率顯著上升，提示CVB3誘導小鼠心肌細胞發(fā)生凋亡(P<0.05，圖2)。CVB3+瑞舒伐他汀組與CVB3誘導組相比，凋亡細胞比率顯著下降(P<0.05，圖2)。實驗結果表明，瑞舒伐他汀抑制CVB3誘導的小鼠心肌細胞凋亡。

2.3瑞舒伐他汀對心肌炎小鼠心臟功能的影響 瑞舒伐他汀組與對照組相比，平均動脈壓(Mean arterial pressure，MAP)、心率(Heart rat，HR)、左心室收縮壓(Left ventricular systolic pressure,LVSP)均沒有顯著變化(P>0.05，圖3)。CVB3誘導組與對照組相比，MAP、HR和LVSP顯著降低(P<0.05，圖3)。CVB3誘導的心肌炎小鼠經(jīng)瑞舒伐他汀加藥后，MAP、HR和LVSP顯著升高(P<0.05，圖3)。實驗結果表明，瑞舒伐他汀改善CVB3誘導心肌炎小鼠的心臟功能。

2.4瑞舒伐他汀對心肌炎小鼠心肌酶的影響 瑞舒伐他汀組與對照組相比，Mb、CK-MB和cTn1的含量差異沒有顯著統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖4)。CVB3誘導組與對照組相比，Mb、CK-MB和cTn1的含量顯著上升(P<0.05，圖4)；CVB3+瑞舒伐他汀組與CVB3組相比，Mb、CK-MB和cTn1的含量顯著降低(P<0.05，圖4)。結果表明，瑞舒伐他汀緩解CVB3誘導的小鼠心肌壞死。

圖1 HE染色觀察心肌組織病理損傷(×400)Fig.1 HE staining was used to observe pathological injury of cardiac tissue(×400)

圖2 TUNEL染色檢測細胞凋亡情況(×400)

Fig.2 TUNEL staining was used to detect apoptosis conditio

Note: Compared with the Ctrl group，*.P<0.05；compared with the CVB3 group，#.P<0.05.

2.5瑞舒伐他汀抑制CVB3誘導的小鼠心肌炎性反應 ELISA檢測心肌組織中炎癥因子的含量，瑞舒伐他汀組與對照組相比，TNF-α和IL-6的含量差異沒有顯著統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖5)。CVB3組與對照組相比，TNF-α和IL-6的含量顯著上升，提示CVB3誘導小鼠發(fā)生炎性反應(P<0.05，圖5)。CVB3+瑞舒伐他汀組與CVB3組相比，TNF-α和IL-6的含量顯著降低(P<0.05，圖5)，表明瑞舒伐他汀抑制CVB3誘導的小鼠心肌炎性反應。

圖3 心臟功能指標的檢測Fig.3 Detection of cardiac function indicatorsNote: Compared with the Ctrl group，*.P<0.05；compared with the CVB3 group,#.P<0.05.

圖4 血液中心肌酶的檢測Fig.4 Detection levels of myocardial enzymesNote: Compared with the Ctrl group,*.P<0.05；compared with the CVB3 group,#.P<0.05.

圖5 ELISA檢測炎癥因子的含量Fig.5 Concentration of inflammatory factors were detec-ted by ELISANote: Compared with the Ctrl group,*.P<0.05；compared with the CVB3 group,#.P<0.05.

3 討論

病毒性心肌炎是常見的心血管疾病，是引起兒童和年輕成年人猝死的重要原因。目前病毒性心肌炎的確切機制并不清楚，心肌炎缺少特異的治療藥物，治療方案以減少心肌負擔、改善心肌營養(yǎng)和消除炎癥為主?？滤_奇病毒是無包膜的單鏈RNA病毒，在消化系統(tǒng)中復制，由呼吸系統(tǒng)和糞便傳播[11]?？滤_奇病毒產(chǎn)生溶細胞毒素使心肌受損，以CVB3的致病性最強[12]。本文以CVB3感染BALB/c小鼠建立病毒性心肌炎模型，探索瑞舒伐他汀對病毒性心肌炎的保護作用。

病毒性心肌炎常造成局限性和彌散性的心肌組織壞死、炎癥細胞浸潤。CVB3組與對照組相比，心肌組織出現(xiàn)明顯的病理變化，表明病毒性心肌炎模型建模成功。由于瑞舒伐他汀具有降脂和心血管功能調(diào)節(jié)能力，在許多疾病中均表現(xiàn)出器官保護作用，如為易中風的大鼠提供終末器官保護作用，對慢性腎病患者具有保護作用[13]。瑞舒伐他汀治療病毒性心肌炎小鼠后，小鼠心肌組織病理損傷明顯減輕，炎癥細胞浸潤明顯減少。實驗結果表明，瑞舒伐他汀能緩解CVB3病毒引起的BALB/c小鼠心肌組織病理損傷。

細胞凋亡在機體生長、發(fā)育等各個階段均發(fā)揮著重要的作用。病毒感染后，導致心肌細胞結構和功能的破壞，同時激活Fas通路、Bcl-2家族和Caspase家族，啟動心肌細胞凋亡[14]。病毒感染造成心肌細胞死亡是導致心肌炎患者心臟功能減退的主要原因。大量報道證實，瑞舒伐他汀能抑制細胞自噬，如Nam等[15]發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀能緩解環(huán)孢霉素誘導腎病大鼠模型的炎癥和凋亡。鮑曉梅等[16]實驗也證實，瑞舒伐他汀抑制高半胱氨酸誘導的內(nèi)皮祖細胞凋亡。本研究結果顯示，瑞舒伐他汀加藥后的病毒性心肌炎小鼠心肌組織細胞凋亡數(shù)目明顯減少，表明瑞舒伐他汀抑制CVB3誘導的小鼠心肌細胞凋亡。

心肌肌鈣蛋白是調(diào)節(jié)肌肉收縮的亞單位，以復合物或游離狀態(tài)存在于心肌細胞中，正常情況下不會在血液中出現(xiàn)。當心肌受損時，心肌肌鈣蛋白被釋放到血液循環(huán)中，因此將心肌肌鈣蛋白作為心肌損傷的特異性標志物[17]。CK-MB是心肌受損的早期指標[18]。肌紅蛋白具有貯存和運輸氧的功能，心肌損傷時，血液中的肌紅蛋白迅速升高[19]。余波等[20]發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死患者服用瑞舒伐他汀后，血清中cTn1和CK-MB的含量顯著降低。本研究ELISA測定結果顯示，加藥處理后的心肌炎小鼠，血液中心肌酶的含量均不同程度地降低。結果表明，瑞舒伐他汀緩解CVB3對小鼠心肌組織的損傷。

TNF-α是巨噬細胞分泌的具有多種生物學效應的細胞因子，能激活炎癥細胞參與炎性反應，介導免疫應答。研究發(fā)現(xiàn)，病毒性心肌炎患者血清中和心肌中TNF-α的水平升高，提示TNF-α與病毒性心肌炎相關[21]。IL-6是機體應對感染和組織損傷產(chǎn)生的重要介質，參與免疫調(diào)節(jié)和炎性反應[22]。大量研究證實，瑞舒伐他汀具有抗炎性反應的作用，如Gianella等[23]研究發(fā)現(xiàn)，瑞舒伐他汀預防中風大鼠的腎臟炎性反應和纖維化。Kim等[24]實驗也證實，瑞舒伐他汀能降低內(nèi)皮細胞中IL-6的表達，抑制炎性反應。本文ELISA實驗結果顯示，瑞舒伐他汀加藥后，心肌炎小鼠的心肌組織中IL-6和TNF-α的含量顯著降低。實驗結果與前人研究一致，表明瑞舒伐他汀抑制心肌炎小鼠的炎性反應。

綜上所述，本文以柯薩奇病毒感染BALB/c小鼠，建立心肌炎小鼠模型，模型小鼠經(jīng)瑞舒伐他汀加藥后，心肌組織的病理損傷減輕，炎性反應和細胞凋亡得到有效的抑制；心臟功能有效緩解。瑞舒伐他汀抑制炎性反應和細胞凋亡的分子機制還有待研究。