李錦源，黃文濤，韋園園，吳 瓊

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院， 南寧 530022)

肝癌是是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢[1-2]。在中國，肝癌的發(fā)病率僅次于肺癌和胃癌，居惡性腫瘤的第三位[3-4]。由于肝癌發(fā)病率高，治療難度大，死亡率高，預(yù)后差，故對其防治工作尤為重要。

苦參素(oxymatrine, OMT)是中藥苦參中提取的一種生物堿活性成分，具有消炎、阻止肝纖維化和肝硬化、抗心律失常、抗腫瘤等作用[5]。全反式維甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)是一種維A酸類衍生產(chǎn)物，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等，還具有很強(qiáng)的抗腫瘤作用。本研究用二乙基亞硝胺(N-nitroso-diethylamin，DEN)為誘變劑建立大鼠肝癌模型[6]，同時(shí)用全反式維甲酸聯(lián)苦參素對其進(jìn)行干預(yù)，觀察在誘癌及干預(yù)過程中大鼠的體征及組織病理學(xué)的動(dòng)態(tài)變化，為闡明肝癌的發(fā)展及有效預(yù)防、治療提供重要參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級雄性6周齡SD大鼠、150只，體重120±25 g，購自購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(桂)2015-0013]，飼養(yǎng)于本院動(dòng)物房 [SYXK(桂)2015-0011]。其中正常組30只，誘癌組60只，干預(yù)組60只，飼養(yǎng)溫度：22℃±4℃，相對濕度：50%±5%，實(shí)驗(yàn)過程符合動(dòng)物3R原則(倫理審批號：2018-2-1-7)。

1.2 主要試劑與儀器

DEN(sigma公司，批號049K1613 V)；苦參素注射液(山東方明藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號180104)；全反式維甲酸(Sigma-Aldrich公司，批號R2625)；SYBR Green PCR Master Mix(日本Toyobo公司，批號QPK-346C);總RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司，批號15695-020); 辣根過氧化物酶(HRP) 標(biāo)記的二抗 (中杉金橋公司)； p-STAT3、STAT3兔單克隆抗體(Genetex公司，批號2467、3571)；HRP標(biāo)記的內(nèi)參β-actin抗體(上?？党缮锕?；IL-6 ELISA試劑盒(上海通蔚，批號20170914)；各基因引物由重慶威斯騰生物公司合成。

ELX800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國Biotek公司)；PEPS301型電泳儀(美國GE公司)；AU500型全自動(dòng)生化分析儀(美國貝克曼公司)；XDS-2型倒置顯微鏡(南京米厘特)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠肝癌模型建立與給藥方法

模型組：DEN劑量為每周第一天灌胃 (10 mg/kg，2.5 mg/mL DEN溶液)，其余6日飲用80 ppm的DEN水溶液，至18周后正常飼養(yǎng)；干預(yù)組(ATRA+OMT)：DENA劑量與模型組相同，將ATRA(2 mg/kg)和OMT(200 mg/kg)混勻后，每2 d灌胃一次，持續(xù)18周。正常組不做任何處理，作為空白對照。

1.3.2 取材

自建模之日起，實(shí)驗(yàn)第6、12、18周各組隨機(jī)抽取8只大鼠，腹腔麻醉后腹主動(dòng)脈取血，采用自動(dòng)生化分析儀檢測堿性磷酸酶(ALP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平。動(dòng)物處死后，取肝組織，置于液氮中保存；對所取肝形態(tài)，顏色，表面癌結(jié)節(jié)數(shù)進(jìn)行觀察和記錄。

1.3.3 病理學(xué)觀察

將取出的肝組織經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，包埋，連續(xù)切片，厚度約3 μm，行HE染色，光鏡下觀察肝組織病理學(xué)改變。

1.3.4 血清中IL-6含量檢測

采用ELISA法檢測血清中IL-6含量，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.5 RT- qPCR檢測肝組織let-7a、NF-κB-p65、IL-6和STAT3 mRNA表達(dá)

分別取各組大鼠肝組織30 mg，Trizol試劑提取總RNA，根據(jù)Revertaid First Strand CDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA，保存在-80℃。GAPDH作為內(nèi)參，采用重慶威斯騰生物公司合成的let-7a、NF-κB-p6、IL-6及STAT3的引物序列，參照SYBR Green熒光PCR試劑盒說明書，配置反應(yīng)體系，依次進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增反應(yīng)。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。最后由計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算并讀出各組Ct值，系統(tǒng)軟件進(jìn)行結(jié)果分析：采用2-ΔΔCt表示目的mRNA的含量。

1.3.6 Western blot檢測

大鼠處死后，迅速取肝組織，采用RIPA裂解法提取總蛋白，并用BCA法測定蛋白濃度并調(diào)至一致。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜，然后脫脂奶粉封閉2 h，加適量一抗STAT3、p-STAT3在4℃孵育過夜，TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗室溫孵育1 h，經(jīng)ECL顯色后膠片曝光顯影，并用Image J軟件對條帶進(jìn)行分析，以A目的蛋白/AGAPDH的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 OMT聯(lián)合ATRA對大鼠肝表面肝癌結(jié)節(jié)形成的影響

正常組大鼠肝顏色淡紅，質(zhì)地柔軟，光滑，無結(jié)節(jié)。在DEN誘導(dǎo)下，建模大鼠會依次經(jīng)歷肝炎，肝硬化進(jìn)而形成肝癌。研究人員發(fā)現(xiàn)在第6周時(shí)，各組大鼠肝沒有結(jié)節(jié)出現(xiàn)，到第12周時(shí)出現(xiàn)少量結(jié)節(jié)，而第18周時(shí)出現(xiàn)大量結(jié)節(jié)。與模型組比較，干預(yù)組肝表面結(jié)節(jié)數(shù)明顯減少，見圖1。

2.2 HE染色觀察各組大鼠肝病理改變

第18周時(shí)，正常組肝細(xì)胞無變性、壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，無炎癥及纖維化；模型組發(fā)生明顯肝細(xì)胞異型性增生，多數(shù)增生肝細(xì)胞核仁普遍增大，出現(xiàn)核異質(zhì)變以及癌變細(xì)胞，且周圍組織肝細(xì)胞異型性明顯，伴癌細(xì)胞浸潤，同時(shí)出現(xiàn)腺管樣及柱狀癌巢結(jié)構(gòu)，周圍的肝組織內(nèi)可見微小癌衛(wèi)星灶。癌周組織肝細(xì)胞增生灶、脂肪變性、嗜酸性變、細(xì)胞水腫，以及增生及非典型增生結(jié)節(jié)，呈典型的肝硬化表現(xiàn)；干預(yù)組肝組織中發(fā)現(xiàn)有癌結(jié)節(jié)，但肝細(xì)胞變性壞死較模型組程度輕、腫瘤病灶數(shù)減少。見圖2。

圖1 第18周時(shí)各組大鼠肝情況觀察Figure 1 Gross appearance of the rat livers at the 18th week

注： 與正常組相比， aP<0.05 ；與模型組相比，bP<0.05。圖2 各組大鼠肝病理改變(n=8)Note. Compared with the normal group， aP<0.05. Compared with the model group， bP<0.05.Figure 2 Pathological changes of the rat livers in each group

2.3 ELISA法檢測血清IL-6含量

建模后第6，12，18周時(shí)與正常組比較，模型組大鼠血清IL-6水平明顯上升(P<0.05)；在第12、18周時(shí)與正常組比較，干預(yù)組大鼠血清IL-6水平也明顯上升(P<0.05)，而第6，12，18周時(shí)與模型組比較，干預(yù)組血清IL-6水平均明顯下降(P<0. 05)，見圖3。

注：與正常組相比， aP<0.05 ；與模型組相比，bP<0.05。圖4 各組大鼠ALT、AST、GGT和ALP水平變化Note. Compared with the normal group，aP<0.05. Compared with the model group，bP<0.05.Figure 4 Changes of ALT, AST, GGT and ALP levels in the rats of each group

2.4 ATRA聯(lián)合OMT對大鼠肝功能的影響

第6、12、18周時(shí)與正常組比較，模型組、干預(yù)組大鼠血清ALT、AST、GGT、ALP水平均明顯升高(P<0.05)；第12、18周時(shí)與模型組比較，干預(yù)組AST、GGT水平均明顯下降(P<0.05)，而第6、12、18周時(shí)與模型組比較，干預(yù)組ALT、ALP水平均明顯下降(P<0.05)，詳見圖4。

注：與正常組相比， aP<0.05 ；與模型組相比，bP<0.05。圖3 各組大鼠血清IL-6水平變化Note. Compared with the normal group, aP<0.05. Compared with the model group, bP<0.05.Figure 3 Changes of serum IL-6 levels in the rats of each group

2.5 ATRA聯(lián)合OMT對大鼠肝組織microRNA let-7a、NF-κB-p65、IL-6和STAT3 mRNA表達(dá)變化

第18周時(shí)，模型組大鼠肝組織microRNA let-7a表達(dá)量低于正常組 (P<0.05)，而干預(yù)組let-7a表達(dá)量明顯上升 (P<0.05)；同時(shí)正常組與模型組或干預(yù)組與模型組比較，大鼠肝組織中NF-κB-p65，IL-6，STAT3 mRNA表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，詳見圖5。

2.6 ATRA聯(lián)合OMT對大鼠肝組織STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)的影響

注：與正常組相比， aP<0.05 ；與模型組相比，bP<0.05。圖5 各組大鼠肝組織中microRNA let-7a、NF-κB-p65、IL-6，STAT3 mRNA表達(dá)變化Note. Compared with the normal group， aP<0.05. Compared with the model group， bP<0.05.Figure 5 Expression of microRNA let-7a, NF-κB-p65, IL-6 and STAT3 mRNA in the liver tissues of rats in each group

第18周時(shí)Western blot檢測結(jié)果：與正常組相比，模型組大鼠肝組織中STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)均明顯上升(P<0.05)，而與模型組相比，干預(yù)組STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)均明顯下降 (P<0.05)，同時(shí)干預(yù)組p-STAT3蛋白表達(dá)較正常組也明顯下降(P<0.05)，見圖6。

3 討論

肝癌是臨床上最常見的消化道惡性腫瘤之一，每年全球范圍內(nèi)約有69萬人死于肝癌，其中我國占約50%[7]。通常早期肝癌治療方式為手術(shù)，或經(jīng)肝動(dòng)脈插管化療栓塞、熱療、放療等，由于多數(shù)病人就診時(shí)已到中、晚期，此時(shí)病人肝功能和體質(zhì)較差，很難耐受手術(shù)治療，多選擇接受化療，常用的藥物包括順鉑、苦參素等[8-10]。

氧化苦參堿是中藥苦參素的主要有效成分，具有抗腫瘤、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)、抗炎鎮(zhèn)痛的作用。大量藥理研究證實(shí)，氧化苦參堿對胃癌、肝癌、直腸癌等細(xì)胞均具有較強(qiáng)的殺傷力[11]；全反式維甲酸在體內(nèi)由維生素A轉(zhuǎn)化而來，是維生素A的一種重要活性代謝物，在癌細(xì)胞增殖，浸潤、轉(zhuǎn)移等各個(gè)階段來發(fā)揮其抑癌作用[12]。

注：與正常組相比， aP<0.05 ；與模型組相比，bP<0.05。圖6 各組大鼠肝組織中STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)Note. Compared with the normal group，aP<0.05. Compared with the model group，bP<0.05.Figure 6 Expression of STAT3 and p-STAT3 proteins in liver tissues of the rats in each group

DEN對腫瘤的發(fā)生具有啟動(dòng)和促進(jìn)的雙重作用，具有重復(fù)性好、誘癌率高、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛運(yùn)用在肝癌的研究中[13]。本實(shí)驗(yàn)HE結(jié)果顯示，模型組明顯肝細(xì)胞異型性增生，多數(shù)增生肝細(xì)胞核仁普遍增大，出現(xiàn)核異質(zhì)變以及癌變細(xì)胞，同時(shí)第18周時(shí)，模型組大鼠肝癌結(jié)節(jié)數(shù)較正常組顯著增多，這說明建模成功。

MicroRNA (miRNA) 是一類內(nèi)源性小分子單鏈非編碼RNA，MiRNA參與調(diào)節(jié)多種癌癥的發(fā)生與發(fā)展，發(fā)揮負(fù)向調(diào)控基因表達(dá)的功能[14-15]。let-7a是目前研究最廣泛的miRNA之一，已被證實(shí)具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)分化和凋亡的功能。let-7a抑制肝癌細(xì)胞的生長主要是通過microRNA作用IL-6，Ras等基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)[16-17]；目前在肝癌與炎癥的關(guān)系中IL-6備受關(guān)注[18]，它參與多種細(xì)胞的增殖和分化、血細(xì)胞的生成及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。STAT3屬于胞漿蛋白家族，具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控的雙重功能，同時(shí)STAT3是IL-6重要的調(diào)節(jié)因子，兩者相互作用，形成互相激活的通路。

本實(shí)驗(yàn)主要考察DEN誘導(dǎo)肝癌中IL-6信號通路的作用，采用ATRA聯(lián)合OMT進(jìn)行干預(yù)治療后檢測肝癌發(fā)生過程中IL-6通過STAT3連接NF-κB構(gòu)成的炎癥-癌癥信號通路的改變[19-20]，同時(shí)觀察IL-6及其上游正調(diào)控基因NF-κB[20]和負(fù)調(diào)控基因1et-7a[21]的改變。HE染色的病理學(xué)觀察及肝功能檢測結(jié)果表明：干預(yù)組大鼠肝表面結(jié)節(jié)數(shù)，肝功能各指標(biāo)水平明顯降低，這提示ATRA聯(lián)合OMT對DEN誘發(fā)的肝癌具有生長抑制作用，受損肝細(xì)胞數(shù)量減少；RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示：不同階段干預(yù)組大鼠肝組織中IL-6、NF-κB-p65 mRNA表達(dá)水平低于模型組，而干預(yù)組microRNA let-7a表達(dá)量顯著高于模型組，這說明ATRA聯(lián)合OMT抑制IL-6 mRNA表達(dá)可能是通過上調(diào)microRNA let-7a mRNA表達(dá)和下調(diào)NF-κB-p65 mRNA表達(dá)來實(shí)現(xiàn)，從而阻斷IL-6信號通路活化。

Western blot結(jié)果顯示，干預(yù)組STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)均顯著低于模型組，提示ATRA聯(lián)合OMT干預(yù)治療能夠明顯抑制大鼠肝癌，其機(jī)制與下調(diào)NF-κB-p65的表達(dá)和上調(diào)let-7a表達(dá)，從而抑制靶基因IL-6的表達(dá)，以及阻斷IL-6/STAT3信號通路活化，進(jìn)而抑制肝癌的發(fā)生和發(fā)展，起到防治肝癌的作用。