景彥林，楊修昭，白振軍，賀千里，彭志鋒

(1.山西大同大學中醫(yī)藥健康服務(wù)學院，山西 大同 037009； 2.大同市第五人民醫(yī)院，山西 大同 037009； 3.山西大同大學醫(yī)學院，山西 大同 037009)

肥胖是世界范圍內(nèi)的一個公共健康問題。肥胖可影響女性的生殖能力。肥胖婦女發(fā)生不孕癥幾率為正常體重者3倍[1]。肥胖導致女性無排卵周期和月經(jīng)不規(guī)則，降低植入率和妊娠率，還可能與多囊性卵巢綜合征有關(guān)[2]。以往研究表明，肥胖可通過影響卵子生長發(fā)育、排卵、內(nèi)膜生長、胚胎發(fā)育和胚胎種植等多方面影響女性生育能力[3]。也有研究指出，高脂飲食(high-fat diet, HFD)誘導肥胖可促進卵泡發(fā)育及卵泡丟失，導致卵巢早衰[4]。還有研究表明，機體中過多脂肪不僅對女性，而且對肥胖動物模型生殖功能均有負面影響[5]。然而，過量體脂干擾正常卵巢功能機制還不清楚，特別是性激素及凋亡在其中作用。因而，本研究采用高脂肪/高熱量飼料喂養(yǎng)，建立Wistar雌性大鼠肥胖模型，深入探討肥胖對Wistar雌性大鼠卵巢功能的影響機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

80只雌性SPF級Wistar大鼠(5周)由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供[ SCXK (晉) 2015 -0001]，體重120～130 g。飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級環(huán)境中[ SYXK (晉) 2015 -0001]。動物實驗嚴格按照山西醫(yī)科大學實驗動物管理委員會制定的操作規(guī)程 (IACUC號:2015011)，符合 3R 原則。Wistar大鼠隨機分為正常飲食組(對照組,n=40)和高脂飲食組(HFD組,n=40)。正常飲食大鼠以標準飼料配方飼養(yǎng)；而HFD大鼠以高脂肪/高碳水化合物飲食飼養(yǎng)，高脂飲食主要包括20%蛋白、35%碳水化合物和45%脂肪(購于中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所)。飼養(yǎng)周期為2個月，每周測2次體重。肥胖判定標準：HFD大鼠體重超過control組20%，而且Lee’s指數(shù)顯著高于control組，即肥胖模型成功[6]。

1.2 實驗試劑

馬松三色染料(美國Sigma公司); TUNEL細胞凋亡試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)；放射免疫分析試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠陰道涂片方法

飼養(yǎng)50 d時，在9～11點間對每只大鼠進行大鼠陰道涂片，通過顯微鏡檢查及時準確判斷大鼠的發(fā)情周期。

1.3.2 生化檢測及馬松三色染色

40只大鼠(每組各20只)在飼養(yǎng)60 d后第1個發(fā)情周期中的發(fā)情期麻醉后經(jīng)心臟穿刺采血。血液儲存在試管，立即檢測血糖。血液進行離心處理，留取上部血清，置于-70℃冰箱中儲存。通過生化分析儀檢測甘油三酯、膽固醇和C-反應(yīng)蛋白。然后取出卵巢，稱重，固定，脫水，切片，貼片，馬松三色染色。

1.3.3 懷孕準備

飼養(yǎng)大鼠60 d時，40大鼠(每組各20只)與有生育能力健康雄性大鼠合籠交配3周，雌雄大鼠比例為2∶1。分離雌鼠繼續(xù)飼喂，直至懷孕。

1.3.4 雌二醇和孕酮測定

從冰箱中取出儲存的血液。采用放射免疫分析試劑盒分別檢測血液中雌二醇和孕酮。

1.3.5 卵泡計數(shù)

如前面所述的大鼠卵巢馬松三色染色。在光學顯微鏡下觀察大鼠卵泡發(fā)育不同階段的細胞數(shù)量，包括原始、初級、次級、竇狀和排卵前卵泡[7]。

1.3.6 凋亡檢測

取出進行馬松三色染色的卵巢切片，參照試劑盒說明進行TUNEL原位染色，凋亡細胞核呈棕色。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 體重與代謝標志物

在研究開始之前，兩組大鼠體重無統(tǒng)計學差異。不同形式喂養(yǎng)后，兩組大鼠體重均增高。飼養(yǎng)60 d后，HFD組大鼠體重高于對照組大鼠，有統(tǒng)計學差異(P< 0.05)(圖1)，而且HFD組大鼠Lee’s指數(shù)高于對照組(P< 0.05)。盡管HFD組大鼠體重增高，但是HFD組大鼠血清甘油三酯、膽固醇和C-反應(yīng)蛋白濃度未發(fā)生明顯改變。相比較，HFD組大鼠空腹血糖濃度高于對照組，有統(tǒng)計學差異(P< 0.001)，提示HFD誘導肥胖和高血糖。

2.2 發(fā)情周期分析

如圖2所示，陰道細胞學檢查發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，HFD組大鼠發(fā)情周期較長，而發(fā)情后期持續(xù)時間較長，發(fā)情間期也較長。

表1 研究前1 d及飼養(yǎng)60 d體重及代謝參數(shù)變化(n=40)

注：與對照組相比，*P<0.01;與第1天相比，#P<0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.01. Compared with the first day,#P< 0.01.

注：與對照組相比,*P<0.05。圖1 兩組飼養(yǎng)大鼠體重變化(n=40)Note. Compared with the control group, *P < 0.05.Figure 1 Weight change of the rats in two groups

注: D:發(fā)情間期; M:發(fā)情后期; P:發(fā)情前期;O:發(fā)情期。圖2 肥胖對大鼠發(fā)情周情的影響(n=20)Note. D， Interestrus. M，Late estrus. P，Preestrus. O，Estrus.Figure 2 Effects of obesity on estrous cycle in the rats

2.3 血清孕酮和雌二醇測定

由于大鼠發(fā)情周期發(fā)生變化，下面進一步分析卵巢功能是否受到肥胖的影響。因而對血清孕酮和雌二醇濃度進行分析。其中兩組大鼠血清孕酮濃度無統(tǒng)計學差異；而HFD組大鼠血清雌二醇濃度低于對照組(P< 0.05)(圖3)。

2.4 卵巢形態(tài)分析

肥胖導致大鼠血清雌二醇濃度降低，下面進一步觀察肥胖對卵泡發(fā)育各階段的影響。如圖4所示，兩組大鼠卵泡發(fā)育各個階段(原始、初級、次級、竇狀和排卵前卵泡)卵泡數(shù)量無統(tǒng)計學差異。此外，兩組大鼠黃體數(shù)量也無統(tǒng)計學差異。然而，在HFD組大鼠發(fā)現(xiàn)卵泡囊腫。

2.5 凋亡分析

TUNEL分析顯示，兩組大鼠竇狀前、竇狀、排卵前卵泡及黃體均有凋亡細胞(圖5)。其中HFD組大鼠竇狀卵泡凋亡數(shù)量高于對照組，有統(tǒng)計學差異(P< 0.001)；然而兩組間竇狀前、排卵前卵泡及黃體凋亡細胞數(shù)量無統(tǒng)計學差異(圖6)。

注:與對照組相比,*P<0.05。圖3 肥胖對大鼠血清孕酮和雌二醇影響(n=20)Note. Compared with the control group, *P < 0.05.Figure 3 Effects of obesity on serum progesterone and estradiol in the rats

圖4 定量分析原始、初級、次級、竇狀、排卵前卵泡及黃體和囊腫(n=10)Figure 4 Quantitative analysis of primitive, primary, secondary, sinusoidal, preovulatory follicles, corpora lutea and cyst in the rats

圖5 典型卵巢切片TUNEL染色(箭頭指示凋亡細胞，× 400)Figure 5 Typical histology of a rat ovary. An arrow indicates apoptotic cells. TUNEL staining

2.6 妊娠分析

與雄性大鼠合籠3周，絕大多數(shù)HFD組大鼠(9/10)均懷孕。然而，HFD組大鼠懷孕晚于對照組大鼠。HFD組大鼠在發(fā)情周期循環(huán)2～3次才能懷孕，而對照組大鼠在第1個發(fā)情周期內(nèi)懷孕(P< 0.01)(圖7)。

3 討論

本研究結(jié)果表明，HFD誘導的肥胖可影響雌性大鼠生殖功能。以往研究表明，肥胖與葡萄糖穩(wěn)態(tài)紊亂密切相關(guān)，可能與胰島素調(diào)節(jié)外周組織葡萄糖代謝能力下降有關(guān)[8]。這些失衡也存在于HFD誘導的肥胖中[9]。因為HFD可增加動物能量攝入，并引起肥胖。在本研究中，HFD喂養(yǎng)的老鼠不僅發(fā)生肥胖，而且血糖濃度異常升高，從而也支持上述觀點，HFD可減少胰島素調(diào)節(jié)糖代謝的能力。肥胖與炎癥狀態(tài)有關(guān)，而且膳食中脂肪含量影響炎癥[10]。為了檢測HFD是否引起炎癥反應(yīng)，測定大鼠中血清C-反應(yīng)蛋白濃度，但無變化。結(jié)果提示肥胖老鼠不形成炎性反應(yīng)。一個可能的解釋是HFD中除了脂肪，碳水化合物含量也較高，再加上飼養(yǎng)時間只有2個月，所以沒有提供足夠脂肪來激活炎癥通路[11]。此外，也有報道稱飲食誘導胰島素抵抗初始階段與炎癥不相關(guān)[12]。

注：與對照組相比，***P<0.001。圖6 定量分析大鼠動情周期中各期卵泡和黃體的凋亡細胞情況(n=10)Note. Compared with the control group, ***P<0.001.Figure 6 Analysis of the apoptotic cells in the rat follicles and corpora lutea during the estrous cycle

圖7 肥胖對大鼠生殖的影響(n=20) Note. Compared with the control group, ** P< 0.001.Figure 7 Effects of obesity on reproduction in the rats

雌激素是由卵泡顆粒細胞在生育期間產(chǎn)生的，肥胖對其合成影響是有爭議的。已有研究報道，肥胖女性血清雌激素濃度高于正常體重女性；但是也有研究指出，肥胖女性血清雌激素濃度較低，可能是由于體重可直接抑制促性腺激素和雌激素的產(chǎn)生[13-14]。與以往研究結(jié)果一樣，在本研究中發(fā)現(xiàn)HFD大鼠血清雌激素濃度降低。眾所周知，雌激素抑制女性食物的攝入和飲水。在嚙齒類動物中，卵巢切除術(shù)導致肥胖發(fā)生，而補充雌激素可抑制肥胖的發(fā)生[15]。所以HFD會導致肥胖，而較低雌激素濃度可能也是肥胖發(fā)展的一個重要原因。低濃度雌激素誘導大鼠發(fā)情間期延長。據(jù)報道，45 d 高脂飲食與大鼠發(fā)情周期及發(fā)情間期延長有關(guān)，而跟換普通飼料可糾正不規(guī)則的發(fā)情周期[16]。在本研究中，人們發(fā)60 d HFD飼養(yǎng)導致大鼠血清雌激素降低，以及發(fā)情間期延長。雌激素在生殖過程中起著關(guān)鍵作用，可影響卵泡的生成。雌激素缺乏導致卵泡閉鎖，最終引起毛囊早期衰竭[17]。此外，雌激素可抑制顆粒細胞凋亡和維持黃體功能[18]。在本研究中，與對照組大鼠比較，肥胖大鼠血清雌激素降低，同時伴隨著竇狀卵泡凋亡數(shù)量增加，結(jié)果提示HFD誘導的雌激素降低與閉鎖卵泡數(shù)量增加相關(guān)。

總之，目前結(jié)果表明，HFD可誘發(fā)大鼠產(chǎn)生肥胖，肥胖可通過降低血清雌激素濃度，卵泡閉鎖，延遲懷孕，最終降低成年雌性大鼠的生殖能力。