翟羽佳，穆寒露，何蓉蓉，李怡芳*

(1.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心藥學部，廣州 510623； 2.暨南大學藥學院，廣州 510632； 3.廣東省疾病易感性及中醫(yī)藥研發(fā)工程技術(shù)研究中心，廣州 510632)

中風又稱為腦卒中，是一種影響大腦內(nèi)部血管和神經(jīng)的疾病。全球每年約有1500萬人中風，500萬人死于中風[1]。中風主要分為出血性中風和缺血性中風，一般缺血性中風影響大腦和大腦內(nèi)的動脈血管，占所有中風事件的80%。如果與其他腦血管疾病分開考慮，中風是僅次于心臟病、癌癥、慢性下呼吸道疾病和意外傷害的第五大致死因素。缺血性中風俗稱腦梗死，一般是由血栓阻塞血管導致的。血管阻塞后致使血流無法通過導致組織無法得到氧氣及糖分等營養(yǎng)物質(zhì)，ATP產(chǎn)生紊亂，金屬離子通道打開引起鈉、鉀、鈣等離子流動紊亂，級聯(lián)興奮性氨基酸的釋放、自由基的產(chǎn)生、線粒體的損傷等進而引起神經(jīng)細胞的死亡。血腦屏障的破壞導致外周物質(zhì)進入腦內(nèi)而加劇損傷過程，其中又有炎癥反應的參與。近些年來，研究人員利用實驗模型對幾千個化合物進行了研究，進行了數(shù)以百計的臨床試驗。即使有些化合物在體外實驗及動物體內(nèi)實驗中顯示出了抗中風的效果，但在臨床試驗中效果并不理想。迄今為止，組織纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，tPA)是迄今為止唯一被美國FDA批準作為缺血性中風的臨床治療用藥。然而，tPA做為一種溶栓劑在實際使用中受到治療窗的限制，臨床上只有少數(shù)患者可以接受tPA的治療[2-3]。同時，在中風的科學研究中，合適的中風研究模型對于病理機制和藥物研發(fā)是非常重要的支撐和保障，目前最常用的缺血中風模型有栓線法、栓子注射法及光照血栓法。本文闡述了光照血栓中風模型的特點及應用，并與其他中風模型進行了對比(表1)。

表1 幾種缺血性中風模型的比較

1 常見的幾種腦缺血中風模型

目前，許多腦缺血中風動物模型被用于研究腦缺血損傷的細胞和分子機制以及抗中風藥物的研發(fā)，其中包括神經(jīng)保護劑的研發(fā)及改善血腦屏障通透性藥物的研發(fā)。嚙齒類動物中風模型被應用的最為廣泛，不同的嚙齒類動物中風模型只能部分地從不同方面模擬人類的中風過程，但不能模擬全部類型。常用的局灶性腦缺血動物模型包括栓子注射法、線栓法、光照血栓法(光化學法)等[4]。

栓子注射法局灶性腦缺血血栓栓塞模型是從頸內(nèi)動脈注射外源性凝血酶凝塊或合成凝血酶阻塞微球體(300 ～ 400 μm)或微球(< 50 μm)。此方法可以較好的模擬人類的中風過程，適用于對中風生理病理過程的研究和溶栓藥物/神經(jīng)保護藥物的開發(fā)，但是模型對于中風的區(qū)域位置、大小和缺血持續(xù)時間等很難控制，重復性較差，造作過程中需要麻醉[4]。

栓線法是制造局灶性缺血中風模型的常用方法，用來制造永久性大腦中動脈阻塞(permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO)，或者暫時性大腦中動脈阻塞(transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)及缺血再灌注。在MCAO模型中，通常經(jīng)頸外動脈缺口插入圓形硅膠包覆尖端的尼龍單絲線直到頸內(nèi)動脈來制造單側(cè)MCAO模型[5]。MCAO是通過在顱骨上安裝激光多普勒血流儀探頭，用于監(jiān)測阻塞開始時皮質(zhì)血流進而確定手術(shù)的有效性。栓子插入后可以一直放在腦中，形成的是pMCAO模型。對于tMCAO模型，栓子停留時間一般是30～120 min，然后拔出栓子形成缺血后再灌注。MCAO模型可以形成較大的缺血面積并且有缺血半暗帶，可以很好的模擬人類的中風過程，重復性也較好[6-7]。MCAO模型在缺血性中風中的神經(jīng)再生、炎癥過程及血腦屏障損傷等的細胞分子機制研究和抗中風藥物的開發(fā)中得到了廣泛應用[8]。但是，此模型對操作技術(shù)要求很高，這一點嚴重影響到了模型的成功率及動物術(shù)后的死亡率。同時，此模型在手術(shù)過程中需要大量的麻醉劑及較長的麻醉時間，還容易產(chǎn)生血管破裂和出血等。此外，此模型不適合溶栓藥物的開發(fā)研究[4]。

2 光照血栓模型

光照血栓模型又叫做光化學血栓模型，1985年Watson等[9]人將其作為大鼠局灶性腦梗死的一種技術(shù)，后來很多研究將其拓展應用于小鼠[10-12]。此模型主要原理是靜脈注射光敏感性染料，如孟加拉玫瑰染料之后在顱骨局部照射引起的光化學反應。光敏感性染料是水溶性的，并且不能透過血腦屏障，因此只能在血液中存在附著于內(nèi)皮，結(jié)合血小板等血液細胞(圖1)。激光照射誘導孟加拉玫瑰染料局部活化，導致腦部小血管單線態(tài)氧等自由基形成，活性氧對血管內(nèi)皮細胞造成的細胞膜氧化損傷導致內(nèi)皮功能紊亂，使血小板聚集進而形成血栓，阻塞微小血管導致局部血栓形成，進一步造成大腦缺血和神經(jīng)細胞的死亡及血腦屏障的開放[13]。與其他腦中風動物模型相比，此模型相對制造簡單，因為其不需要機械性操作腦血管或腦實質(zhì)。病灶大小和位置可以通過改變輻照強度、曝光時間、光束位置及染料濃度來調(diào)節(jié)。除此之外，光照血栓性梗死可以長期存在，因此適合于腦中風的長期研究[14-15]。

圖1 光照血栓中風模型示意圖Figure 1 Schematic diagram of the induction of photothrombotic stroke

2.1 光照血栓模型的病理機制

光照血栓的病理過程與其它模型有共同點，也有本身的獨特性。在激光照射后與血液內(nèi)染料接觸，單態(tài)氧及自由基的產(chǎn)生可以迅速的導致血小板的凝集和纖維蛋白凝塊的生成而形成血栓[14, 16]。血管內(nèi)血栓阻塞了血液的流動，導致氧氣和葡萄糖的缺乏，進而是氧化磷酸化和ATP生成紊亂[17]，導致細胞離子通道的異常開放，如Na+的內(nèi)流和K+的外流，致使細胞膜內(nèi)外滲透壓改變，誘導細胞水腫。同時谷氨酸大量釋放與NMDA受體結(jié)合后級聯(lián)下游效應。Ca2+釋放內(nèi)流到細胞內(nèi)，與線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合，進一步的產(chǎn)生ROS(包括O2-、ONOO-、OH-等)，開啟程序性細胞死亡過程[18]。此外，ATP的匱乏、Ca2+的內(nèi)流和ROS都可以使細胞膜損傷，破壞細胞的構(gòu)架，除了導致細胞死亡之外，還會影響到血腦屏障的穩(wěn)定性[19-21]。血腦屏障作為大腦的屏障，一旦受到破壞則使正常生理狀態(tài)下大腦中不存在的物質(zhì)進入大腦，加劇病理過程[22]。Ca2+可以激活內(nèi)切核酸酶，與產(chǎn)生的ROS都可以導致細胞內(nèi)DNA損傷[23]。同時，Ca2+誘導的鈣蛋白酶和組織蛋白酶的上調(diào)使細胞內(nèi)多種蛋白降解，導致神經(jīng)細胞死亡[24-25]。ROS可以激活JNK/Bcl-2，NF-κB等信號導致細胞凋亡和壞死[26-27]。另外，ROS也可以引起鐵凋亡[28]。多種死亡形式可能同時發(fā)生在神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞和毛細血管內(nèi)皮細胞中。病理過程中炎性反應的參與，對于神經(jīng)細胞的死亡及血腦屏障的破壞也有一定的促進作用[29]。

光照血栓可以直接導致血管內(nèi)皮細胞的損傷。微血管內(nèi)皮細胞作為血腦屏障的骨架架構(gòu)，損傷后直接導致血腦屏障通透性的增加，誘導細胞外水腫的形成[30]。所以在光照血栓模型中，細胞水腫和血管源性細胞外水腫幾乎同時在早期發(fā)生，這一點與MCAO模型及臨床情況有所差別。圖2為光照血栓中風損傷機制示意圖。

圖2 光照血栓中風損傷機制示意圖Figure 2 Schematic diagram of the damaging mechanism of photothrombotic stroke

2.2 光照血栓模型的優(yōu)點

光照血栓性中風的主要特點是大腦小血管的阻塞。此模型的優(yōu)勢非常明顯，主要有以下幾點：第一，光照血栓可以預設在特定的區(qū)域。與臨床中通常發(fā)生的腦中動脈阻塞中風不同，光照血栓形成在暴露于激光照射的區(qū)域內(nèi)，在血管內(nèi)的血液中形成栓子，同時損傷淺表血管及阻滯血液流動。因此調(diào)節(jié)激光的照射位置、強度、照射時間及血液中染料的劑量，可以對血栓及病灶部位、大小進行相應的控制[12, 31]。第二，此模型的神經(jīng)損傷分子機制與永久性腦中風大體相似，都可以在腦中血管阻塞后引起糖氧剝奪，進而引起一系列反應導致?lián)p傷。因此適用于病理過程、神經(jīng)保護、神經(jīng)再生的細胞和分子機制研究，以及預防治療中風藥物的開發(fā)研究[32-38]。第三，光照血栓模型的創(chuàng)傷性相對小，不需要開顱手術(shù)而只是需要打開被照射部位的皮膚及使顱骨變薄，因此操作簡單。并且模型動物的死亡率低，通常低于10%，遠低于其它中風模型[39]。第四，許多研究證明此模型所誘導的中風穩(wěn)定性高、重復性好，相關神經(jīng)功能障礙時間持續(xù)久，對于長期的實驗觀察驗證具有優(yōu)勢[31, 39]。第五，與其它模型相比，對血壓和血管結(jié)構(gòu)的遺傳變異具有獨立性，并且此模型可以凝集血小板，因此可以用于血小板的血栓相關炎癥和凋亡的研究[40]。第六，此模型使用的麻醉時間相對較短，可以盡可能少的減少麻醉劑對于實驗結(jié)果的干擾[4, 10]。

2.3 光照血栓模型的缺點

首先，光照血栓性梗死不僅僅阻塞血管，并且會嚴重損傷血管壁，在早期引起非典型血管源性水腫。這一點與實際臨床中的中風發(fā)病過程有著較大的差異，不能很好的模擬人類中風水腫生成情況。光照血栓可以同時引起細胞毒性誘導的細胞內(nèi)水腫和細胞外的血管性水腫，是一個雙重水腫幾乎同時發(fā)生的過程。然而，臨床中病人中風的特點是細胞毒性誘導的細胞內(nèi)水腫首先發(fā)生，接下來幾個小時逐漸生成血管性水腫[41]。其次，與其它局灶性中風模型相比，光照血栓性的另一個缺點是由于細胞壞死和組織水腫的程度較重，導致此模型的局部缺血半暗帶狹窄或缺失[17, 30, 42]，并且只有少量的或者觀察不到局部側(cè)支血流及缺血再灌注過程[42]。由于逆轉(zhuǎn)缺血半暗帶是臨床上神經(jīng)保護治療的主要目標之一，所以此模型在這一方面的應用不是十分理想。再次，與其它中風模型比較由于皮質(zhì)部位病灶損傷區(qū)相對較小，動物的運動感覺功能損傷也相對較輕[39]。另外，在臨床實際情況中，典型的局灶性缺血性中風涉及大腦中動脈中特定節(jié)段的血栓阻塞，而不是在大腦皮質(zhì)中眾多小動脈和微血管中的血栓阻塞[4]。

3 光照血栓中風模型在藥物開發(fā)中的應用

無論是預防性給藥還是造模后治療性給藥，已有許多針對缺血性中風的藥物利用光照血栓模型進行了研究及驗證。有些研究通過此模型尋找抑制鈣通道、谷氨酸興奮性毒性和氧化應激的化合物進而達到神經(jīng)保護的目的。Lorrio等[43]人通過研究發(fā)現(xiàn)，化合物ITH33/IQM9.21可以通過減少鈣超載，保護線粒體并且具有抗氧化的作用而改善缺血性中風。Aerden等[34]發(fā)現(xiàn)地西泮做為鈣離子通道阻滯劑，可以有效地減小大鼠光照血栓模型的腦梗死面積。有些研究通過一些相關酶或者受體的效應探討一些藥物的藥效及作用機制[44]。López-Valdés等[50]認為美金剛可以拮抗谷氨酸受體，起到改善中風的作用。Park等[38]發(fā)現(xiàn)二甲胺四環(huán)素強力霉素可以再光照血栓模型中抑制金屬蛋白酶9(MMP-9)，而MMP-9與緊密連接蛋白的調(diào)節(jié)有著重要的聯(lián)系，影響血腦屏障。Wang等[45]發(fā)現(xiàn)煙酰胺在可以通過調(diào)節(jié)NAD+/BDNF/TrkB 通路，減小光照血栓中風小鼠的腦缺血面積及改善行為學功能。Yan等[51]發(fā)現(xiàn)三七皂苷Rb1可以調(diào)節(jié)Akt/mTOR/PTEN通路改善光照血栓大鼠的中風癥狀。表2列舉了部分利用光照血栓模型進行研究的藥物。

表2 通過光照血栓模型研究的具有抗中風潛力的代表性藥物

4 結(jié)語

大腦小血管阻塞是光照血栓性中風模型的模式特點。與其它中風模型相比，其優(yōu)勢包括可以調(diào)整激光照射在特定的大腦區(qū)域內(nèi)及控制激光照射強度和照射時間、控制血栓形成的部位和大小、創(chuàng)傷性小、操作簡單并且動物的死亡率低。另外，該模型的中風相關神經(jīng)功能障礙時間持續(xù)久并且穩(wěn)定，具有重復性好，穩(wěn)定性高的特點。光照血栓性中風模型也有著一些劣勢，例如腦水腫的形成與臨床實際情況不符、缺血半暗帶的形成面積很小或者幾乎沒有、神經(jīng)功能的損傷相對其它模型輕微。綜上所述，光照血栓性中風模型在缺血性中風的神經(jīng)保護、神經(jīng)再生的細胞和分子機制研究及尋找治療中風的潛在藥物研究中可以發(fā)揮一定的模型支撐作用。除此以外，有研究者利用此模型研究“心腦交互作用”，發(fā)現(xiàn)小鼠在中風后免疫細胞入侵心臟，導致了慢性心功能不全的癥狀出現(xiàn)[61]；也有研究報道光照血栓法還可以應用于心肌梗死及三叉神經(jīng)痛等模型的建立[62-63]。所以，盡管光照血栓模型有缺點和不足，但是其應用的優(yōu)勢更加的顯著。在未來的應用中除了可以對化合物進行應用及研究，還可以應用于具有神經(jīng)保護作用的具有抗中風潛力的中藥及復方制劑的研究。作為有效的模型，除了應用于中風疾病模型外，也可以拓展應用于心血管疾病的缺血模型、肝臟缺血模型、腎臟缺血模型等。光照血栓模型可以在未來相應的機制研究和藥物開發(fā)研究中提供有力的模型支撐。