萬雪超，盧秋芬，何玉玲，方 艷

(貴州省銅仁市人民醫(yī)院，貴州 銅仁 554300)

妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，研究發(fā)現(xiàn)妊娠期高血糖可導致胎兒各種先天畸形，如導致心血管畸形和神經(jīng)系統(tǒng)畸形的幾率是正常妊娠的3～5倍[1]。GDM引起子代心肌微結(jié)構(gòu)異常的比例明顯增多[2]。CD4+CD25+T細胞作為部分高表達IL-2受體α鏈分子的CD4+T細胞，其表達水平降低與病毒性心肌炎、心力衰竭、冠心病等多種心臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，Tregs的激活具有抑制CD4+T細胞介導的炎癥反應以及免疫細胞殺傷功能[3-5]；炎癥狀態(tài)下， CD4+細胞亞群中Th2細胞(分泌IL-4)及Th17細胞(分泌IL-17)表達失衡。研究發(fā)現(xiàn)[6]，程序性凋亡分子-1(PD-1)及免疫球蛋白黏蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)分子3(Tim-3)對CD4+CD25+Treg 細胞具有調(diào)節(jié)作用，且介導CD4+T細胞所產(chǎn)生的炎癥反應。2型糖尿病存在明顯的免疫功能下降，而CD4+CD25+T細胞水平下降參與了2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展， CD4+CD25+Treg細胞及IL-4高表達有助于機體胰島功能的保護[7]。需要指出的是，在妊娠高血糖狀態(tài)下CD4+T細胞水平表達是否存在差異，妊娠糖尿病母鼠胎鼠心臟功能異常是否與CD4+T細胞水平有關(guān)，值得研究報道。

miRNAs是真核生物鐘較為常見的一類內(nèi)源性具有基因或蛋白調(diào)控作用的非編碼RNA，其具有調(diào)控糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的作用。通過現(xiàn)有文獻以及課題組前期研究顯示，糖尿病患者存在多種miRNAs表達差異。其中，miR-223-3p在2型糖尿病及其并發(fā)癥中呈顯著低表達[8]；miR-223-3p除了參與血糖代謝以外，還參與動脈粥樣硬化病變，其在冠心病機體表達量顯著降低[9]；在煙曲霉誘導的CD4+細胞中，miR-223-3p低表達致多種炎性因子呈高表達狀態(tài)[10]。但需要指出的是，miR-223-3p是否參與GDM的發(fā)生以及其對GDM子代心臟功能是否有影響，miR-223-3p是否具有調(diào)節(jié)CD4+T細胞及其介導的炎癥反應，進而導致GDM子代心臟功能異常是值得進一步深入研究的。

本研究目的主要在于探討GDM胎鼠心臟組織中miR-223-3p表達情況，以及其對CD4+T細胞表達水平與其介導的炎癥因子釋放的影響，以期為臨床有效預防及治療GDM子代心臟功能異常提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級SD大鼠(采購于廣東省實驗動物中心，[SCXK(粵)2018-0027]，雌、雄性分別為100只、50只(雌性250～290 g，雄性270～300 g)。動物飼養(yǎng)于恒溫(25℃左右)、相對濕度在40%～70%、安靜的動物房中。實驗期間所有動物均正常進食、飲水，不給予胰島素以及其他任何降糖藥物。所有動物實驗均經(jīng)倫理委員會審查(動物倫理審查號：201803033)。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型建立

實驗前大鼠自由進食飼料，每天維持12 h燈光照明，每隔一天更換墊料一次，記錄體質(zhì)量以及血糖含量(血糖含量在7 mmol/L者剔除)。參照國外Rees等[11]的造模方法復制GDM模型，具體方法為：受試動物按照雌雄2∶1的比例進行合籠，次日早晨5:00檢查陰栓，查到有陰栓則定為交配成功，并記為妊娠0 d。將妊娠成功的84只母鼠進行編號，隨機分為模型組(鏈脲佐菌素streptozotocin, STZ組，n=42只)和正常對照組(NC組，n=42只)。其中STZ組孕鼠于確定受精后的12 h后，注射含量為45 mg/kg的STZ(溶于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中)，NC組注射相應體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。注射72 h后即妊娠第4天，經(jīng)眼眶取血，離心分離血清測定空腹血糖含量在11.1 mmol/L，隨機血糖在17.9 mmol/L，尿糖 >++，表明為妊娠糖尿病，即造模成功。

1.2.2 心臟標本組織收集及處理

所有孕鼠均于妊娠第20天麻醉，剖腹取出子宮，觀察胎鼠的個數(shù)(是否存在死胎、吸收胎等)，將胎鼠置于天平上稱重并觀察是否存在其他畸形情況。取出每只孕鼠中所有子鼠心臟組織一并稱重，洗凈后按照心臟組織每5.00 mg置于液氮中保存，用于RT-PCR檢測以及相關(guān)蛋白檢測用。剩余心臟組織用于HE染色及免疫組化病理學檢查。

1.2.3 免疫組化檢測胎鼠心臟組織中CD4+CD25+Treg 細胞表達

采用福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供的兩步法檢測CD4+CD25+Treg細胞表達情況。具體操作步驟為：將切好的標本置于60℃烤箱中1 h，石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化、蒸餾水沖洗3次，每次沖3 min，取800 mL檸檬酸緩沖液于壓力鍋中，加熱至沸騰，將經(jīng)水化后的組織放置于耐高溫塑料架上，并置于沸騰的檸檬酸緩沖液中1.5 min，取出后自然冷卻至室溫，采用PBS沖洗3次，每次沖洗3 min；將切片浸入3% H2O2溶液中，室溫放置20 min后取出，采用PBS沖洗3次，每次3 min，加入一抗(兔抗人CD4+CD25+Treg多克隆抗體，體積比1∶500，購自美國Stana公司)室溫孵育1.5 h；收集一抗后，采用PBS沖洗3次，每次3 min，用濾紙輕輕吸干PBS后加入二抗(過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，體積比為1∶1000)室溫孵育1 h，PBS沖洗3次，每次3 min；加入DAB顯色劑，蘇木素復染，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性膠固定，顯微鏡下觀察。以細胞膜以及細胞漿中出現(xiàn)棕黃色信號為陽性細胞。

1.2.4 胎鼠心臟組織中miR-233-3p表達

采用實時熒光定量PCE法，以NAPDH作為內(nèi)參，檢測胎鼠心臟組織中miR-233-3p表達情況。采用Trizol法提取胎鼠心臟組織中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取2 μL用于PCR反應，反應體系為25 μL，miR-233-3p正向引物：5’-GTCATTGTTGA GTGCTCGTAACGC-3’，反向引物：5’-CGTGGT CGGTCGGTAAACGCGTCG-3’；NAPDH正向引物：5’-CAGGAGGTTAGTGCTACGTATGCTTGC-3’，反向引物：5’-CAAGGCTGCGTGCGGTCTCGA-3’。反應條件為95℃預變性 1 min，94℃變性15 s，延伸72℃ 25 s，退火65℃ 30 s，共40個循環(huán)；NAPDH退火條件為60℃ 20 s，其他同上。采用2-ΔΔCT法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析。

1.2.5 Western blotting檢測組織中IL-17、IL-4、Tim-3及PD-1表達

取胎鼠心臟組織約100 mg置于勻漿器中，并加入蛋白酶抑制劑的裂解液 500 μL在冰上進行裂解。按照試劑盒說明要求提取蛋白，加入5× SDS上樣緩沖液煮沸7～8 min，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉、洗膜加入一抗、室溫孵育4℃封閉過夜；TBST洗膜3次，加入二抗。將化學熒光發(fā)光底物均勻地加到膜的表面，置于曝光試劑盒中曝光，顯影、定影等，采用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況分析

GDM組母鼠平均血糖值(17.36±0.62)mmol/L高于NC組母鼠(5.81±0.57)mmol/L且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。GDM組子鼠吸收胎、死胎、畸形胎例數(shù)高于NC組，差異有統(tǒng)計學意義。(表1)

2.2 各組胎鼠心臟組織病理變化

通過HE染色顯示，GDM組與NC組比較，心肌組織增厚明顯，高倍鏡下可見GDM組心肌纖維排列稀疏，心肌顯微斷裂，心肌細胞腫脹，細胞核肥大或固縮，而NC組襲擊細胞排列整齊、致密，心肌顯微無斷裂，細胞核染色清晰。(圖1)

2.3 免疫組化檢測CD4+CD25+Treg細胞表達情況

采用免疫組化檢測顯示，GDM組CD4+CD25+Treg CD4+CD25+Treg陽性細胞表達數(shù)量[(46.41±10.94)%]低于NC組[(21.63±10.94)%]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(圖2)

2.4 RT-PCR檢測組織中miR-233-3p表達

采用RT-PCR檢測組織中miR-233-3p表達，結(jié)果顯示，GDM組miR-233-3p相對表達量(0.682±0.104)低于NC組(0.466±0.117)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。(圖3)

表1 兩組胎鼠畸形胎比率比較(n=42，%)

圖1 心臟組織的病理學改變。HE染色。Figure 1 Histological changes in the heart tissues of fetal rats. HE staining.

圖2 免疫組化檢測胎鼠心臟組織中CD4+ T細胞表達Figure 2 CD4+ T cells in the fetal rat heart tissues. Immunohistochemical staining.

2.5 Western blotting檢測IL-17、IL-4、Tim-3及PD-1表達

圖3 RT-PCR檢測胎鼠心臟組織中miR-233-3p表達Figure 3 Detection of miR-233-3p expression in fetal rat heart tissues by RT-PCR

采用Western blotting檢測分析顯示，GDM組IL-17、Tim-3及PD-1表達量均高于NC組，而IL-4顯著低于NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)(圖4)。

3 討論

GDM可導致胎兒發(fā)育異常，尤其是導致胎兒心臟畸形的發(fā)生率明顯增高。研究顯示[12]，GDM孕婦中胎兒心血管畸形發(fā)生率是正常孕婦的3～5倍，但高血糖或糖尿病導致胚胎發(fā)育畸形的機制研究尚不明確。有研究認為[13]，高血糖或GDM與細胞免疫功能失衡有關(guān)，高血糖與CD4+細胞表達降低顯著相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)[14]，糖尿病患者CD4+CD25+Treg細胞比例顯著低于健康人員，且與糖化血紅蛋白呈負相關(guān)；通過胰島素治療或降血糖藥物治療，患者血清中CD4+CD25+Treg細胞水平及IL-4等顯著升高。CD4+CD25+Treg作為CD4+T細胞特有的一個亞群，其表達量降低導致多種心臟疾病，如冠心病，病毒性心肌炎、慢性心力衰竭等疾病的發(fā)生發(fā)展；以上表明血糖升高與機體免疫功能紊亂存在顯著相關(guān)性，而免疫功能紊亂是誘發(fā)多種心臟疾病的重要原因。通過本研究，發(fā)現(xiàn)GDM組胎鼠心臟組織中CD4+CD25+Treg表達量顯著低于NC組，提示妊娠高血糖引起的免疫功能紊亂，可能導致胎兒心臟發(fā)育不良。

圖4 Western blotting檢測兩組胎鼠心臟組織中PD-1、Tim-3、IL-4、IL-17表達情況Figure 4 Western blotting detection of PD-1, Tim-3, IL-4, IL-17 expressions in the fetal rat heart tissues

CD4+T細胞介導多種炎性因子參與糖尿病、心肌重構(gòu)、心肌炎等疾病的發(fā)生發(fā)展。不同的CD4+T細胞亞群發(fā)揮不同的作用，促炎性Th細胞亞群包括Thl、Thl7等比例上調(diào)或功能亢進，而抗炎性的Th2、Treg等比例下降或功能受損是促發(fā)慢性炎癥狀態(tài)的直接因素[15]。血糖增高可導致巨噬細胞吞噬功能下降、Th1/Th2比例失調(diào)、細胞因子表達異常等。研究發(fā)現(xiàn)[16]，在血管緊張素Ⅱ誘導的高血壓大鼠模型中，當灌注血管緊張素Ⅱ后Th2型細胞因子IL-4的數(shù)量明顯下降，而Th1型細胞因子IFN-γ明顯增高，表明Th1/Th2失衡參與了臨床心血管事件的發(fā)生。Th17細胞主要參與介導慢性炎癥、自身免疫性疾病以及腫瘤等疾病的發(fā)生，其特異性的分泌IL-17細胞因子，能夠發(fā)揮較強的促炎癥作用，參與誘導炎性細胞因子、趨化因子的表達[17]。那么， CD4+T細胞介導的炎癥反應是否參與GDM子代心肌結(jié)構(gòu)與功能異常，研究報道較少。通過本研究，相關(guān)人員發(fā)現(xiàn)GDM組胎兒心臟組織中IL-17表達量顯著增高，而IL-4表達量顯著降低，提示GDM胎兒存在明顯的CD4+T細胞表達差異。

PD-1在多種疾病中發(fā)揮重要作用，其與程序性細胞死亡分子受體1(PD-L1)結(jié)合后組成PD-1/PD-L1信號通路，具有誘導T淋巴哦細胞的凋亡，抑制T細胞的活化與增殖。研究顯示[18]，在2型糖尿病患者血清中CD4+PD-1+細胞占比顯著增高，而CD4+CD25+Treg細胞比例下降，提示在高血糖下， CD4+CD25+Treg細胞水平與PD-1表達呈負相關(guān)。在心房顫動、動脈粥樣硬化等疾病中也顯示[19-20]，PD-1在CD4+細胞中呈高表達，且具有促進炎性細胞因子的釋放作用。Tim3被研究證實特異性表達于Th1細胞，具有活化Th1細胞的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病腎病、先天性心臟病患者血清中Tim3呈高表達。但CD4+細胞中PD-1、Tim3表達是否與GDM胎鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能異常有關(guān)，是值得研究的。通過本研究，相關(guān)人員發(fā)現(xiàn)GDM胎鼠心臟組織中PD-1、Tim3均顯著高于NC組，提示PD-1、Tim3高表達參與了GDM子代心臟組織結(jié)構(gòu)功能異常的發(fā)生發(fā)展。

多項研究顯示[21-22]， microRNAs參與調(diào)解T淋巴細胞亞群表達，調(diào)控糖尿病及其并發(fā)癥、心臟疾病的發(fā)生發(fā)展，對于GDM胎兒心臟組織存在哪些microRNAs表達差異值得研究。研究發(fā)現(xiàn)[23-24]，miR-233-3p在缺血性心肌微血管內(nèi)皮細胞中呈低表達，而且與糖尿病腎病嚴重程度呈負相關(guān)，糖尿病腎病嚴重程度越高，miR-233-3p表達量越低，以上提示miR-233-3p表達可能參與了糖尿病、心臟疾病的發(fā)生發(fā)展。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-CD4+T細胞中miR-233-3p低表達促進了Th17分化以及IL-17表達，進而誘導炎癥級聯(lián)反應。目前，miR-233-3p在GDM胎鼠中表達如何研究較少。通過本研究發(fā)現(xiàn)，GDM組胎兒心臟組織中miR-233-3p表達量顯著低于NC組，提示GDM胎鼠心臟功能異?？赡苁桥cmiR-233-3p表達小調(diào)，進而介導CD4+T細胞表達下降，導致多種炎性因子表達異常有關(guān)。

綜上， GDM子鼠心臟結(jié)構(gòu)與功能異?？赡芘cCD4+T細胞表達下降有關(guān)，而這一作用機制可能與胎鼠心臟組織中miR-233-3p表達下調(diào)及其介導的炎癥因子表達異常有關(guān)。