姜文清，戚 艷，沙若荷，章 欣，陳靜越，潘 偉，孫芬芬*

(1.江蘇省免疫與代謝重點實驗室，病原生物學與免疫學教研室； 2.臨床醫(yī)學系； 3.基礎醫(yī)學國家級實驗教學示范中心；徐州醫(yī)科大學，江蘇 徐州 221004)

磷脂酰膽堿(phosphatidyl choline，PC)，亦稱卵磷脂，是細胞膜和細胞器膜的重要組成部分[1]。傳統(tǒng)用法上，PC作為一種保健品，具有安神補腦、美容養(yǎng)顏、減肥與清理血管內(nèi)垃圾等功能。但新近發(fā)現(xiàn)該成分亦具有免疫調(diào)節(jié)作用[2-3]。研究證實，tuftsin-PC復合物可改善小鼠類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)病情，其機制可能與誘導調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Tregs)和調(diào)節(jié)性B細胞(regulatory B cells，Bregs)增多有關[4]；不僅如此，該化合物還可通過誘導DC細胞產(chǎn)生IL-10以改善小鼠炎癥性腸炎病情[3]。

多烯磷脂酰膽堿(polyene phosphatidyl choline，PPC)，是一種護肝藥，臨床上廣泛應用于各種肝病類型的治療[5-8]，包括酒精所致肝纖維化、肝細胞脂肪變性及非酒精性脂肪性肝炎等。PPC的主要成分為PC，提示PPC可能具有抗炎作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PPC可下調(diào)LPS誘導的巨噬細胞(macrophages， M?)炎癥反應，并能改善大鼠類風濕性關節(jié)炎病情[9]。這提示PPC具有治療炎性疾病的潛力。深入探討PPC的作用機制將為開發(fā)PPC作為抗炎藥提供理論基礎，但目前尚不明確。

第10號染色體缺失的張力蛋白-磷酸酶同系物 (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)，是1997年人類發(fā)現(xiàn)的第一個具有磷酸化酶功能的抑癌基因[10]。其編碼蛋白可調(diào)控細胞生長發(fā)育、凋亡、遷移、信號傳遞等[11-12]。那么，PTEN是否參與了PPC的抗炎過程，尚不明確。本研究以小鼠M?系Raw264.7為模型，探討PPC對LPS誘導M?炎癥的調(diào)控作用以及PTEN在上述過程中的作用，研究結(jié)果將為開發(fā)PPC作為抗炎藥奠定實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 巨噬細胞細胞系

Raw 264.7細胞株由本實驗室保存。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM/HIGH Glucose培養(yǎng)基 (美國Hyclone公司)，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(美國Gibco公司)，PTEN及β-actin抗體(英國Abcam公司)，抗兔二抗(武漢ABclonal公司)，小鼠IL-6、IL-10、TNF-α ELISA檢測試劑盒(美國eBioscience公司)，多烯磷脂酰膽堿注射液(賽諾菲安萬特(北京)制藥有限公司)，PrimeScriptTMRT Master Mix(日本Takara公司)，TransStart Top Green qPCR SuperMix(北京金式全生物有限公司)，LPS (美國Sigma公司)，SF1670(PTEN抑制劑，美國ApexBio公司)，ECL化學發(fā)光試劑盒(德國Millipore公司)，青霉素、鏈霉素溶液(美國Gibco公司)。

熒光定量PCR儀(德國Roche Light?Cycler480Ⅱ)，分光光度計(Nanodrop Lite)，酶標儀(美國Biotek酶標儀)，Western blot電泳濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，CO2細胞培養(yǎng)箱(德國Thermo Scientific)，TRIzol(碧云天)。

1.3 實驗方法

1.3.1 巨噬細胞系培養(yǎng)

RAW264.7細胞以5×105/mL鋪于6孔板，每孔2 mL完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 μg/mL)。于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)及實驗。

1.3.2 實驗分組

(一)PPC對LPS誘導M?炎癥反應的調(diào)控作用研究

實驗分為4組：PBS組、PPC組(20 μg/mL)、LPS組(100 ng/mL)、LPS(100 ng/mL)+PPC(20 μg/mL)組。每組3個重復孔。加入上述刺激培養(yǎng)24 h后，收集上清后，向細胞中加入Trizol，反復吹打，待細胞裂解充分后，收集細胞裂解液。以上樣本置于-80℃冰箱備用。

(二)PTEN在PPC調(diào)控LPS誘導M?炎癥反應中的作用研究

實驗分為6組：PBS組、PPC組(20 μg/mL)、LPS組(100 ng/mL)、LPS(100 ng/mL)+ PPC(20 μg/mL)組，PPC(20 μg/mL) + SF1670 (150 ng/mL)、LPS(100 ng/mL)+ PPC(20 μg/mL)+ SF1670 (150 ng/mL)。每組3個重復孔。加入上述刺激培養(yǎng)24 h后，樣本收集同前。

1.3.3 實時熒光定量RT-PCR檢測IL-6 mRNA表達情況

收集上述各組TRIzol裂解細胞，抽提RNA，用TransStart Top Green qPCR SuperMix試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA后，運用實時熒光定量PCR檢測IL-6 mRNA表達情況。引物序列見表1。熒光定量PCR反應體系(20 μL 體系)為：上游引物：10 μmol/L，1 μL；下游引物：10 μmol/L，1 μL；SYBR Green Ⅰ：10 μL；ddH2O: 7 μL； cDNA：1 μL。熒光定量PCR擴增條件為：預變性95℃ 5 min；PCR反應95℃ 15 s，60℃ 15 s，75℃ 15 s，共45個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，校正目標基因的表達量，應用2-△△Ct法計算各基因的相對表達量。

表1 用于實時熒光定量RT-PCR的引物序列

1.3.4 Western blot檢測PTEN表達

收集各組細胞沉淀，加入RIPA裂解液后，抽提總蛋白，定量后，進行蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別用稀釋濃度為1∶1000的PTEN、β-actin抗體孵育4℃過夜。Washing buffer洗3次，每次15 min。稀釋度為1∶5000抗兔二抗室溫孵育2 h，washing buffer洗3次，每次15 min，ECL顯影后用Image Lab軟件進行圖片分析。

1.3.5 ELISA檢測測炎癥相關因子蛋白含量

采用美國eBioscience公司 ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)上清中IL-6、IL-10、TNF-α水平。具體操作按照說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 PPC對LPS誘導M?炎癥因子的影響

為探討PPC對炎癥反應的調(diào)控作用，用ELISA檢測培養(yǎng)上清中炎癥相關因子的含量(圖1)。PPC組TNF-α、IL-6、IL-10的含量分別為(26.007±7.764)pg/mL、(15.181±5.619)pg/mL、(138.809±44.789)pg/mL，與PBS組的(17.827±3.704)pg/mL、(10.565±1.709)pg/mL、(153.822±14.277)pg/mL，無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)。LPS+PPC組炎癥相關因子TNF-α、IL-6的含量分別為(87.977±13.374)pg/mL、(109.875±11.029)pg/mL，顯著低于LPS組炎癥相關因子含量(561.402±42.748)pg/mL、(686.887±37.841)pg/mL(P<0.001)，而LPS+PPC組IL-10為(3433.795±302.731)pg/mL，顯著高于LPS組的(1105.894±92.478)pg/mL(P<0.001)。以上結(jié)果表明，PPC能顯著抑制LPS誘導的M?炎癥反應。

注：圖中四組bar依次代表巨噬細胞經(jīng)過PBS、LPS、PPC、LPS+PPC處理后上清中TNF-α、IL-6及IL-10的含量。與LPS 組比較，**P<0.01; ***P<0.001。圖1 PPC對LPS誘導M?細胞炎癥因子分泌的影響Note. The four groups of bars in the figure show the content of TNF-α,IL-6 and IL-10 in supernatant of macrophages treated with PBS, LPS, PPC and LPS+PPC. Comapred with the PPC group，**P<0.01; ***P<0.001。Figure 1 The effects of PPC on the secretion of inflammatory cytokines in macrophages induced by LPS

2.2 PPC對LPS活化M? 細胞中PTEN表達的影響

為探討PPC調(diào)控炎癥的信號通路，利用Western blot檢測上述各組PTEN蛋白表達情況(圖2)。相比PBS組，LPS組PTEN表達下降(P<0.05)；PPC組PTEN表達升高(P<0.001)。相對LPS組，PPC+LPS組PTEN表達量顯著升高(P<0.001)。以上結(jié)果提示，PPC可能通過作用于上調(diào)PTEN抑制LPS誘導的M?炎癥反應。

注：圖中A代表性Western blot,圖中B四組bar依次代表巨噬細胞經(jīng)過PBS、LPS、PPC、LPS+PPC處理后PTEN的相對表達量。與LPS 組比較，**P<0.01; *** P<0.001。圖2 PPC對LPS活化Raw264.7細胞中PTEN表達的影響Note. Figure 2A, Western blot. Figure 2B, The relative expression of PTEN in macrophages treated with PBS, LPS, PPC and LPS+PPC. Comapred with the PPC group, **P<0.01; ***P<0.001.Figure 2 The effects of PPC on the PTEN expression of Raw 264.7 cells activated by LPS.

2.3 SF1670對PPC調(diào)控M?炎癥因子的影響

為明確PTEN是否參與PPC下調(diào)LPS誘導的M?炎癥反應，向上述培養(yǎng)體系中加入PTEN抑制劑SF1670，ELISA及實時熒光定量RT-PCR檢測炎癥因子的表達變化(圖3)。PPC+SF1670組TNF-α含量為(42.286 ± 5.737) pg/mL，顯著高于PPC組(P<0.05)；PPC組為IL-6相對表達量為(1.690 ± 0.251)，顯著低于PPC+SF1670組的(29.627 ± 6.469)(P<0.001)；而PPC組IL-10含量與PPC+SF1670組無明顯差異(P>0.05)。PPC+LPS+SF1670組TNF-α含量為(786.876±234.499) pg/mL，顯著高于PPC+LPS組的(165.310 ±40.763) pg/mL(P<0.05)； PPC+LPS+SF1670組IL-6的表達量為(316.695±23.262)，顯著高于PPC+LPS組(P<0.001)； PPC+LPS+SF1670組IL-10含量為(2869.317±106.722) pg/mL，顯著低于PPC+LPS組的(5100.46 ±856.631) pg/mL(P<0.05)。以上結(jié)果表明，PTEN參與了PPC下調(diào)LPS誘導M?炎癥反應。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)PPC能下調(diào)LPS誘導的巨噬細胞炎癥反應，并證明PTEN參與PPC的抗炎作用。作為一種經(jīng)典護肝藥物，近些年來發(fā)現(xiàn)PPC也可治療重癥胰腺炎[13]、急性膿毒癥[14]、類風濕性關節(jié)炎[3]等非肝臟疾病；但其抗炎機制需進一步探討。

注：上清中TNF-α、IL-10的含量及細胞中IL-6的相對表達量。與LPS+PPC 組比較，**P<0.01; *** P<0.001。圖3 PTEN抑制后PPC對LPS誘導M?細胞炎癥反應的影響Note. The content of TNF-α and IL-10 in supernatant and relative expression of IL-6 in macrophages. Comapred with the LPS+PPC group，**P<0.01; *** P<0.001。Figure 3 The effects of PPC on LPS induced inflammatory response in macrophages after inhibition of PTEN

本研究發(fā)現(xiàn)，PPC并不會誘導正常M?細胞產(chǎn)生炎癥反應，與課題組前期報道PPC對M?細胞的增殖與凋亡均無明顯影響相符[9]。但PPC能明顯抑制LPS誘導的M?細胞釋放促炎因子IL-6、TNF-α的分泌，并促進抗炎因子IL-10的分泌。在M?細胞炎癥反應中，TNF-α 與IL-6 是主要的炎性因子。其中，TNF-α可通過介導T細胞的激活與增殖來促進炎癥反應，而IL-6可通過淋巴細胞的激活與增值、B細胞的分化、白細胞的募集以及肝內(nèi)急性蛋白反應來促進炎癥活動，從而在炎性疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[15]。IL-10主要由單核細胞和淋巴細胞產(chǎn)生，被認為是最重要的抗炎因子之一[16]。目前，針對IL-6、TNF-α的抗體及受體阻斷劑已被開發(fā)用于治療自身免疫性疾病[17-18]。本研究結(jié)果提示，PPC具有較好的抗炎潛力，可能用于治療炎性疾病。

本研究還證實，PPC發(fā)揮抗炎作用與其上調(diào)PTEN有關。PPC能顯著上調(diào)M?細胞PTEN表達，而采用抑制劑SF1670抑制PTEN表達，PPC不能下調(diào)LPS誘導的炎癥反應。有研究顯示，PTEN可通過催化3, 4, 5-三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate, PIP3)去磷酸化拮抗PI3K活性[19]，下調(diào)PI3K/AKT通路從而抑制下游信號分子NF-κB與mTOR的激活[20-21]。PI3K是由一個催化亞基(p110α/β/γ/δ)和一個調(diào)節(jié)亞基(p85α/β)組成的雜二聚體蛋白[22]。在細胞被生長因子或細胞因子激活后，PI3K催化D3位的4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate, PIP2)轉(zhuǎn)化生成PIP3。AKT通過血小板同源結(jié)構(gòu)域(pleckstrin homology domain, PH domain)與PIP 3結(jié)合，引起AKT構(gòu)象的改變，隨后AKT在Ser473/474被磷酰肌醇依賴性激酶2(phosphoinositide-dependent kinase-2, PDK-2)激活[23]。AKT能激活多種基因的轉(zhuǎn)錄，特別是那些參與免疫激活、細胞增殖、凋亡和細胞存活的基因。已有研究證明PI3K/AKT參與NF-κB活化及NF-κB依賴性細胞因子的表達，激活各種炎癥基因的轉(zhuǎn)錄，促進炎癥因子生成，誘發(fā)炎癥反應[24]。此外，下調(diào)PI3K/AKT信號軸也可能促進M?細胞向M2型分化[25]。在CCl4誘導小鼠肝纖維化進展逆轉(zhuǎn)模型中，PTEN可以下調(diào)PI3K/AKT/STAT6信號通路，促進巨噬細胞向M2型分化[26]。結(jié)合前人研究，本研究推測PPC可能通過上調(diào)PTEN表達，下調(diào)PI3K/AKT通路，以抑制M?細胞釋放炎癥因子，但具體機制尚需進一步證實。