孫建海，馬燕凌，魏武杰，晏 菲，方紅艷，瞿 姣

(江漢大學(xué)附屬湖北省第三人民醫(yī)院腫瘤科， 武漢 430033)

肝癌是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率均位于腫瘤前列。全球每年新增肝癌患者約為70萬例，僅次于肺癌；我國每年新增肝癌患者30萬左右，占全球肝癌總患者50%左右[1-3]。由于肝細(xì)胞具有較強(qiáng)的代償功能，80%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)處于中晚期，手術(shù)和放化療的效果較差，術(shù)后有超過60%的患者發(fā)生了肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，其術(shù)后5年生存率不超過5%，癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移成為肝癌主要的致死原因[4-5]。目前研究者一直致力于從肝癌細(xì)胞增殖和遷移的分子機(jī)制去改善肝癌的預(yù)后與治療。通過Oncomine數(shù)據(jù)庫整合疾病基因表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)c受體樣蛋白(Fc receptor like proteins，F(xiàn)CRL)家族蛋白在原發(fā)性肝癌中顯著升高，但其作用機(jī)制至今未明[6-7]。FCRL3是FCRL家族的重要一員，通過 Oncomine數(shù)據(jù)庫整合原發(fā)性肝癌組織(對比于正常肝臟組織)表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CRL3在原發(fā)性肝癌中顯著升高，提示FCRL3蛋白可能在原發(fā)性肝癌中起關(guān)鍵作用，F(xiàn)CRL3蛋白與多種免疫相關(guān)性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、甲亢等，但其在肝癌中的作用尚未清楚[8-10]?；谏鲜鲆罁?jù)，探討FCRL3在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)及其對肝癌細(xì)胞HepG2增殖和遷移的影響，為FCRL3成為肝癌治療靶點(diǎn)提供一定的研究依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

48例肝癌組織來源于我院外科手術(shù)切除肝癌患者的癌組織，40例人正常肝組織來源于我院外科因外傷切除的正常肝臟組織。癌組織和正常組織均通過病理學(xué)進(jìn)行確診(本研究得到江漢大學(xué)附屬湖北省第三人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)(倫理審批號：20180215)，病人及家屬均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

肝癌細(xì)胞HepG2(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，中國)，脂質(zhì)體Lipofectamine 2000，F(xiàn)CRL3過表達(dá)病毒載體和siRNA干擾表達(dá)病毒載體(上海吉?jiǎng)P生物公司，中國)，青鏈霉素溶液、胰酶(Corning公司，美國)，RPMI-1640和胎牛血清(Gibco公司，美國)，Trizol Reagent RNA提取試劑盒(Invitrogen公司，美國)、PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TaKaRa公司，中國)、UltraSYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒(寶生物工程大連有限公司，中國)、FCRL3和GADPH引物(大連TaKaRa公司，中國)，PCR引物序列(上海生工生物工程有限公司，中國)：FCRL3引物序列：上游引物為5’-AACAGGAAAATAATACAAATGTACAGACCA-3’，下游引物為：5’-GGGAAAGAAGACACGAAAGCA-3’；GAPDH引物序列：上游引物為5’-TCCCATCACCATCTTCCAG-3’，下游引物為：5’- GGTATCCATCGCCATGCTC -3’，四噻唑藍(lán)(Methyl tihiazolyl tetrazolium，MTT)(Amresco公司，美國)、細(xì)胞蛋白抽提試劑(碧云天生物技術(shù)研究所，中國)，鼠抗FCRL3單克隆抗體(Santa Cruz公司，美國)，辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記親和純化山羊抗小鼠IgG二抗、鼠抗GADPH單克隆抗體(武漢艾美捷科技有限公司，中國)，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱 (Thermo Revco，美國)，NanoDrop2000c 型蛋白核酸檢測儀(Thermo公司，美國)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司，美國)，倒置顯微鏡(Nikon公司，日本)，基質(zhì)膠、Bio-Rad 垂直電泳儀(BD公司，美國)，凝膠成像儀(UVP 公司，美國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)肝癌細(xì)胞HepG2，條件為37℃、5% CO2，隔天換液，當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)用胰酶消化后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為FCRL3干擾表達(dá)組、FCRL3陰性對照組和FCRL3過表達(dá)組。FCRL3干擾表達(dá)組加入FCRL3 siRNA干擾表達(dá)病毒載體和脂質(zhì)體、陰性對照組只加入脂質(zhì)體、FCRL3過表達(dá)組加入過表達(dá)病毒載體和脂質(zhì)體，轉(zhuǎn)染成功后繼續(xù)培養(yǎng)24 h收獲細(xì)胞，進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測FCRL3 mRNA的表達(dá)

取肝癌組織、正常肝組織和HepG2各組細(xì)胞，根據(jù)RNA提取試劑盒操作說明書進(jìn)行總 RNA提取，測定mRNA濃度和純度，將提取的總RNA根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTMII熒光定量PCR試劑盒說明，用制備20 μL反應(yīng)體系，在CFX-96 PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃ 30 s、 變性 95℃ 5 s、60℃ 44 s、40個(gè)循環(huán)，61℃時(shí)采集熒光，用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀檢測對其表達(dá)量進(jìn)行結(jié)果分析，以GADPH作為內(nèi)參，采用 2-△△ Ct法計(jì)算FCRL3 mRNA 的相對表達(dá)量。

1.3.3 Western blot法檢測FCRL3蛋白水平

取肝癌組織、正常肝組織和肝癌細(xì)胞HepG2各組細(xì)胞，根據(jù)組織和細(xì)胞量加入胞蛋白抽提試液，冰浴2 h；4℃、10 000 r/min、15 min，取上清，進(jìn)行蛋白定量；調(diào)整蛋白濃度，加入1/5體積的5× Buffer，沸水進(jìn)行變性，-80℃保存?zhèn)溆?。采?Bio-Rad 濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)SDS-PAGE 膠進(jìn)行電泳、切膠；孵育一抗、 4℃下孵育相應(yīng)條帶過夜、孵育相對于二抗，采集圖像，用凝膠成像儀對免疫印跡條帶灰度值并進(jìn)行分析。

1.3.4 MTT法檢測肝癌細(xì)胞HepG2增殖率

各組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染成功后進(jìn)行消化，以每孔5×103接種于96孔板中，每孔200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入MTT 每孔50 μL。培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入DMSO 每孔200 μL，振蕩10 min，用檢測的吸光度值(OD值)，計(jì)算HepG2細(xì)胞增殖率[細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)]。每各劑量組設(shè)3個(gè)平行孔。

1.3.5 細(xì)胞劃痕法檢測肝癌細(xì)胞HepG2遷移能力

各組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染成功后進(jìn)行消化，調(diào)整細(xì)胞濃度，以每孔5×104接種于6孔板內(nèi)，每孔200 μL，加入1 mL含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h左右，使細(xì)胞形成單層細(xì)胞爬滿孔板底部，用100 μL滅菌槍頭在單層細(xì)胞上呈“一”字劃痕，用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基清洗3次，加無血清培養(yǎng)基溫育細(xì)胞24 h，用顯微鏡下拍照，每孔3～5個(gè)視野。用圖像分析儀測量測量劃痕寬度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織和正常肝組織內(nèi)FCRL3 mRNA及蛋白的表達(dá)

與正常肝組織比較，肝癌組織內(nèi)FCRL3 mRNA和蛋白表達(dá)量均增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.54、3.87，P<0.05)(表1，圖1)。

表1 肝癌組織和正常肝組織內(nèi)FCRL3 mRNA及蛋白的表達(dá)

注：與正常肝組織比較，aP<0.05。

Note. Compared with normal liver tissue，aP<0.05.

2.2 FCRL3干擾表達(dá)組、FCRL3陰性對照組和FCRL3過表達(dá)組肝癌細(xì)胞HepG2內(nèi)FCRL3 mRNA及蛋白的表達(dá)

與FCRL3干擾表達(dá)組比較，F(xiàn)CRL3陰性對照組和FCRL3過表達(dá)組肝癌細(xì)胞HepG2內(nèi)FCRL3 mRNA表達(dá)量和蛋白量均增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與FCRL3陰性對照組比較，F(xiàn)CRL3過表達(dá)組肝癌細(xì)胞HepG2內(nèi)FCRL3 mRNA表達(dá)量和蛋白量均增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2，圖2)。

2.3 FCRL3表達(dá)對肝癌細(xì)胞HepG2增殖率和遷移能力的影響

與FCRL3干擾表達(dá)組比較，F(xiàn)CRL3陰性對照組和FCRL3過表達(dá)組肝癌細(xì)胞HepG2增殖率和遷移能力增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與FCRL3陰性對照組比較，F(xiàn)CRL3過表達(dá)組肝癌細(xì)胞HepG2增殖率和遷移能力增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3，圖3)。

表2 FCRL3干擾表達(dá)組、FCRL3陰性對照組和FCRL3過表達(dá)組肝癌細(xì)胞HepG2內(nèi)FCRL3 mRNA及蛋白的表達(dá)

注：與FCRL3干擾表達(dá)組比較，aP<0.05；與FCRL3陰性對照組比較，bP<0.05。

Note.Compared with the normal FCRL3 interference expression group，aP<0.05. Compared with the normal FCRL3 negative control group，bP<0.05.

表3 FCRL3表達(dá)對肝癌細(xì)胞HepG2增殖率和遷移能力的影響

注： FCRL3干擾表達(dá)組比較，aP<0.05；與FCRL3陰性對照組比較，bP<0.05。

Note. Compared with the normal FCRL3 interference expression group，aP<0.05.Compared with the normal FCRL3 negative control group,bP<0.05.

圖2 各組肝癌細(xì)胞HepG2內(nèi)FCRL3 mRNA及蛋白的表達(dá)Figure 2 The expression of FCRL3 mRNA and protein in hepatocellular carcinoma cells in different groups

3 討論

肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)參與因素多、多階段的復(fù)雜過程，同時(shí)與基因、環(huán)境等密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移嚴(yán)重影響腫瘤患者的預(yù)后[11]。FCRL基因位于人類染色體lq21-23區(qū)域，與Fc受體相鄰，具有與Fcy受體高度結(jié)構(gòu)同源性，因此認(rèn)為FCRL受體與Fcy受體有類似功能，參與了多種自身免疫性疾病[12]。FCRL主要在B細(xì)胞上表達(dá)，參與了B細(xì)胞的活化和免疫應(yīng)答等，在NK細(xì)胞及T細(xì)胞亞群上也有一定的表達(dá)[13]。FCRL家族主要包括FCRL1-6、FCRLA和FCRLB，通過Oncomine數(shù)據(jù)庫整合原發(fā)性肝癌組織表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)FCRL蛋白家族多個(gè)分子(FCRL1、FCRL3、FCRL4、FCRL5)在原發(fā)性肝癌中顯著升高。

FCRL3基因是一種新的免疫調(diào)節(jié)基因，長度約24 kb堿基序列，包含16個(gè)外顯子和15個(gè)外含子，其編碼蛋白用藥3～9個(gè)免疫球蛋白(Ig)樣結(jié)構(gòu)域，包含免疫受體酪氨酸活化和抑制基序(ITAM和ITIM)，通過細(xì)胞信號傳導(dǎo)參與免疫調(diào)節(jié)功能[14-15]。FCRL3是唯一在B系細(xì)胞以外還表達(dá)的FCRL家族成員，同時(shí)還可以T細(xì)胞群和NK細(xì)胞上表達(dá)，主要表達(dá)在淋巴結(jié)、扁桃體及胸腺等二級淋巴器官上，參與了機(jī)體自身免疫性疾病的過程，與自身免疫性甲狀腺疾病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等病遺傳易感性相關(guān)[16-17]。研究表明，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB能影響FCRL3在B細(xì)胞的表達(dá)水平，而NF-κB參與機(jī)體防御反應(yīng)、組織損傷和應(yīng)激、細(xì)胞分化和調(diào)亡以及腫瘤生長抑制過程的信息傳遞[18]。既往主要集中在FCRL家族對免疫性疾病，本研究創(chuàng)新性研究FCRL3與肝癌的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織內(nèi)FCRL3 mRNA和蛋白表達(dá)量均較正常肝組織增加。本研究通過調(diào)控肝癌細(xì)胞HepG2內(nèi)FCRL3表達(dá)，通過細(xì)胞增殖和遷移能力檢測發(fā)現(xiàn)，降低FCRL3表達(dá)后，細(xì)胞增殖率和遷移能力均降低，同時(shí)，增加FCRL3表達(dá)后，細(xì)胞增殖率和遷移能力均增加。

綜上所述，肝癌組織中FCRL3的表達(dá)水平升高，抑制FCRL3的表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移，提示FCRL3可能在肝癌發(fā)生過程中發(fā)揮重要的作用，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。