黃 琦，廖 鑫，吳 芹，王 攀，石京山*

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，貴州 遵義 563000； 2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，貴州 遵義 563000； 3.遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563000)

糖尿病是常見的代謝性疾病之一，往往與其他代謝性疾病并存，例如肥胖、非酒精性脂肪肝、高脂血癥等。胰島素抵抗和或胰島素分泌不足是糖尿病的主要病理生理特征，而胰島素抵抗、肥胖、血脂紊亂及脂肪肝構(gòu)成代謝綜合征的中心環(huán)節(jié)?；瘜W(xué)藥物中對代謝綜合征進(jìn)行干預(yù)的藥物較少，而傳統(tǒng)中藥對于改善血糖的優(yōu)勢雖不如化學(xué)藥物那樣直接和效果顯著，但其對代謝綜合征多種組成疾病的干預(yù)有其優(yōu)勢。本課題組前期初步研究發(fā)現(xiàn)金釵石斛總生物堿(DendrobiumnobileLindl. alkaloids，DNLA)對實(shí)驗(yàn)性糖尿病動物模型有保護(hù)作用[1,2]。DNLA可降低 db/db小鼠血糖，其機(jī)制與改善胰島素抵抗有關(guān)[3]。本題擬進(jìn)一步探討DNLA對以糖尿病、非酒精性脂肪肝(NAFLD)為主要組份的代謝綜合征的干預(yù)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性SD大鼠，6周齡，體質(zhì)量200～220 g，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供[SCXK-軍2014-005]。實(shí)驗(yàn)在遵義醫(yī)學(xué)院教育部基礎(chǔ)藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行[SYXK (黔) 2014-003]。倫理審查編號：倫審[2017] 2-016號。本實(shí)驗(yàn)操作遵循3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

金釵石斛產(chǎn)于貴州省赤水市石斛種植基地，DNLA由貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提取，總堿含量> 98%；鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)購自美國Sigma公司；鹽酸二甲雙胍片，由中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)；大鼠超敏胰島素放免試劑盒，購自美國LINCO公司。蘇木精、伊紅，為北京賽馳生物科技有限公司產(chǎn)品，多聚賴氨酸、胰島素抗體及相關(guān)免疫組化試劑，購自中國武漢博士德生物工程有限公司。奧林巴斯AU2700型自動生化分析儀(日本Olympus公司)，放免計數(shù)儀Gcr-2010(GAMBYT-CR型，中國科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)，尼康光學(xué)顯微鏡(Nikon儀器有限公司)，低溫離心機(jī)(centrifuge 5417R，德國Eppendorf公司)，強(qiáng)生穩(wěn)步倍加型血糖儀及血糖試紙(強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物模型的制備

SD大鼠62只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，然后給予高脂高糖飼料連續(xù)喂養(yǎng)4周，在禁食8 h后給予STZ (40 mg/kg)腹腔注射一次，3 d后每日剪尾取血測定空腹血糖，篩選出空腹血糖連續(xù)3 d ≥ 11.1 mmol/L者為實(shí)驗(yàn)用模型大鼠[4-5]，成模大鼠共60只，2只大鼠于造模后第3天因血糖過高死亡。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

選取雄性SD大鼠10只設(shè)為空白組。模型大鼠按血糖、體質(zhì)量隨機(jī)分組為：模型組、DNLA 低劑量組、DNLA 中劑量組、DNLA 高劑量組、二甲雙胍組，每組10只。各組大鼠均每日灌胃1次，連續(xù)4周，模型組及空白組給予等體積的雙蒸水灌胃，給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃。

1.3.3 標(biāo)本采集及檢測

各組大鼠連續(xù)灌胃4周，禁食8 h麻醉生效后行腹主動脈取血，應(yīng)用低溫離心機(jī)分離血清待測?？崭寡?FPG)應(yīng)用全自動生化分析儀檢測，空腹胰島素(FINS)使用大鼠超敏胰島素試劑盒，采用放射免疫法進(jìn)行檢測。根據(jù)測得的FPG及FINS結(jié)果，按公式計算出各組大鼠的胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR (HOMA-IR=FPG × FINS/22.5)[6]。麻醉取血后處死大鼠，取出肝臟及胰腺組織，用4%中性甲醛固定48 h，進(jìn)行石蠟包埋后制備組織切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅染色，常規(guī)脫水、封片后顯微鏡下觀察組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)。同時采用免疫組化法檢測胰島中胰島素的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 DNLA對糖尿病合并NAFLD大鼠FPG、FINS、HOMA-IR的影響

模型組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR明顯高于空白組(P< 0.05)；與模型組比較，DNLA中劑量、DNLA高劑量組及二甲雙胍組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR明顯下降(P< 0.05)，見表1。

表1 DNLA對糖尿病合并NAFLD大鼠FPG、FINS、HOMA-IR的影響

注：：，與空白組比較，*P<0.05。與模型組比較，#P<0.05。

Note. Compared with the blank group,*P< 0.05. Compared with the model group,#P< 0.05.

2.2 DNLA對糖尿病合并NAFLD大鼠肝臟組織形態(tài)的影響

空白組大鼠肝內(nèi)肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，模型組大鼠肝小葉內(nèi)肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡狀脂肪變性，肝細(xì)胞核被脂滴推向一側(cè)，形態(tài)酷似脂肪細(xì)胞。二甲雙胍組大鼠肝臟脂肪變性程度明顯較模型組減輕。DNLA 40、80 mg/kg不同程度的減輕糖尿病合并NAFLD大鼠肝臟脂肪變性，見圖1。

注：A：空白組；B：模型組； C：二甲雙胍組； D：DNLA低劑量組； E：DNLA中劑量組； F：DNLA高劑量組。圖1 DNLA對糖尿病合并NAFLD大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響(HE染色)Note. A, blank group. B, model group. C, metformin group. D, DNLA low-dose group. E, DNLA medium-dose group. F, DNLA high-dose group.Figure 1 Effects of DNLA on liver histology in the diabetic rats with NAFLD. HE staining.

2.3 DNLA對糖尿病合并NAFLD大鼠胰島組織形態(tài)及胰島素表達(dá)的影響

大鼠胰腺組織病理切片進(jìn)行HE染色后顯微鏡下觀察，空白組大鼠胰島呈橢圓形，邊界清晰，島內(nèi)細(xì)胞數(shù)均較多；模型組大鼠胰島萎縮，形狀結(jié)構(gòu)不規(guī)則，島內(nèi)細(xì)胞數(shù)減少，出現(xiàn)部分空泡化結(jié)構(gòu)；二甲雙胍組與空白組大鼠相比較，胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)減少；DNLA中、高劑量組與模型組比較，胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)較多，見圖2(左列)。免疫組化染色后鏡下觀察到模型大鼠胰島數(shù)目較空白組減少，與HE染色結(jié)果相一致，同時可見胰島中胰島素表達(dá)明顯減少；與模型組比較， DNLA中、高劑量組胰島內(nèi)胰島素表達(dá)有不同程度增加，見圖2(右列)。

注：A：空白組；B：模型組； C：二甲雙胍組； D：DNLA低劑量組； E：DNLA中劑量組； F：DNLA高劑量組； 左列：HE, ×400；右列：免疫組化 IHC, ×400。圖2 DNLA對糖尿病合并NAFLD大鼠胰腺組織形態(tài)學(xué)及胰島內(nèi)胰島素表達(dá)的影響Note. A, blank group. B, model group. C, metformin group. D, DNLA low dose group. E, DNLA medium dose group. F, DNLA high dose group. Left column: HE staining. Right column: immunohistochemical Staining.Figure 2 Effects of DNLA on pancreatic histology and INS expression in the diabetic rats with NAFLD

3 討論

代謝綜合征是機(jī)體發(fā)生的一種以蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等物質(zhì)代謝紊亂的病理生理狀態(tài)，是一組十分復(fù)雜的代謝紊亂癥候群，其組份包括高血糖、血脂紊亂、超重或肥胖、高血壓等，其基本特征是胰島素抵抗。本研究探討了DNLA對糖尿病合并NAFLD大鼠模型的胰島素抵抗的影響，該模型同時具有高血糖、血脂代謝紊亂、非酒精性脂肪肝，這與文獻(xiàn)報道相符合[7-10]，動物模型成熟且能反應(yīng)代謝綜合征的特點(diǎn)。

目前化學(xué)藥物對代謝綜合征的治療主要是針對各自的疾病進(jìn)行不同的用藥，僅有少數(shù)藥物可同時發(fā)揮多重作用，例如二甲雙胍在降血糖的同時可改善血脂代謝紊亂及脂肪肝[11-12]，這在本研究中也同樣觀察到這一結(jié)果。

中藥的多靶點(diǎn)作用在改善胰島素抵抗、保護(hù)胰島β細(xì)胞、調(diào)節(jié)血脂、減輕脂肪肝方面具有潛在優(yōu)勢。石斛屬DendrobiumSw. 是蘭科重要的屬之一。石斛作為中藥材，已被廣泛使用達(dá)千年。近幾十年來，國內(nèi)外學(xué)者從石斛屬植物的藥用部位中分離鑒定出多種化合物，包括生物堿、多糖、黃酮等類化合物。石斛在緩解糖尿病及其并發(fā)癥、抑制腫瘤、抗氧化、抗炎等方面的有一定藥理作用[13-14]。多項(xiàng)研究證實(shí)石斛有明確的降血糖作用，且對胰島功能有保護(hù)作用[15-16]，而石斛的特征性成分是生物堿。

本課題組采用不同糖尿病動物模型研究了貴州赤水產(chǎn)金釵石斛生物堿對糖脂代謝的影響，不僅局限于其降糖作用的研究，更強(qiáng)調(diào)對整體模型動物代謝紊亂的干預(yù)，前期已發(fā)現(xiàn)DNLA能降低糖尿病模型鼠血糖、血脂，本研究進(jìn)一步證實(shí)了其降糖作用，同時觀察到DNLA改善了糖尿病合并NAFLD大鼠的胰島素抵抗，減輕代謝綜合征在肝臟及胰島的病理進(jìn)展，保護(hù)胰島 β 細(xì)胞功能，改善模型大鼠的代謝紊亂綜合征。DNLA改善胰島素抵抗的機(jī)制，本課題組前期應(yīng)用db/db小鼠研究已發(fā)現(xiàn)可能與上調(diào)端粒酶活性、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶、TERC mRNA表達(dá)，增加POT1、TFR2蛋白表達(dá)水平、下調(diào)TRF1蛋白表達(dá)有關(guān)[3]。

綜上所述，DNLA可改善糖尿病合并NAFLD大鼠高血糖、肝臟脂肪變性，其機(jī)制與其改善胰島素抵抗有關(guān)，詳細(xì)的其他分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。