華海俠，劉瑞吉，于曉麟，趙 敏

(1.腫瘤內(nèi)科； 2.呼吸內(nèi)科； 3.病理科；秦皇島市第一醫(yī)院，河北秦皇島 063000)

作為最常見的惡性腫瘤，肺癌的發(fā)病率和死亡率占全部惡性腫瘤的第一位，其中70%～80%的肺癌是非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，但確診為NSCLC時，70%以上的患者已經(jīng)失去了手術(shù)機會，即使輔以放、化療等多種綜合治療手段，仍然不能顯著提高肺癌的生存率[1]。因此尋找NSCLC早期診斷標記物及靶向治療位點一直是腫瘤研究領(lǐng)域的難點和熱點問題。而上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)這一重要的生理/病理過程可能參與了對腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)控，同時也是腫瘤細胞發(fā)生放、化療耐性的重要機制之一[2]。

組蛋白去乙酰化酶家族(histone deacetylases, HDACs)是一類能夠促進組蛋白/非組蛋白去乙酰化的種類酶類，與細胞增殖、凋亡、DNA損傷關(guān)系密切。I類HDAC主要包括HDAC1、2、3和8；II類HDAC由HDAC4、5、6、7、9和10組成；III類HDAC包括Sir2相關(guān)酶類(Sirtuins, SIRT)1-7；IV類HDAC目前僅有HDAC11被發(fā)現(xiàn)。最近研究顯示HDAC家族與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，能夠抑制相關(guān)抑癌基因的轉(zhuǎn)錄，而一些HDAC抑制劑亦被發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)、外能夠抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲[3]。

在體外培養(yǎng)的NSCLC細胞株中，HDAC抑制劑能夠顯著抑制腫瘤細胞增殖，并促進E-鈣粘蛋白(E-cadherin)的表達[4]。而作為IIb類HDAC，HDAC6的缺失表達能夠促進順鉑誘導的NSCLC細胞DNA損傷和凋亡，抑制HDAC6的表達能夠減少裸鼠體內(nèi)移植瘤的體積，并促進其壞死和凋亡的增加，而高表達HDAC6則可能促進對順鉑的抗性增加[5]。同時HDAC6參與對腫瘤細胞增殖和遷移的調(diào)控受到Rho相關(guān)卷曲螺旋激酶(Rho-associated coiled-coil kinase, ROCK)[6]和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)1/2[7]信號的調(diào)控。在其他腫瘤中也發(fā)現(xiàn)，HDAC6與泛素化失衡、微管蛋白的缺失表達和氧化應激關(guān)系密切，其在卵巢癌、乳腺癌和食管癌、胃癌的發(fā)生發(fā)展中也起到了重要的調(diào)控作用[2]。因此本研究擬通過分析HDAC6、E-cadherin在NSCLC臨床樣本中的表達及其臨床病理意義，并觀察靶向HDAC6抑制轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor, TGF)-β1介導的A549細胞EMT的作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

收集2008年6月～2012年6月期間在秦皇島市第一醫(yī)院胸外科進行手術(shù)切除并經(jīng)病理診斷證實的NSCLC標本52例，所有患者臨床資料完整，均為肺癌原發(fā)病灶，無其他腫瘤病史；術(shù)前均未接受放、化療治療；無肝炎、肝硬化、自身免疫性疾病或其他嚴重的基礎(chǔ)疾病。以腫瘤組織石蠟標本作為實驗組，并挑選同例患者的癌周肺組織石蠟標本作為對照組(鏡下無癌細胞浸潤及轉(zhuǎn)移)，所有標本采用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm切片，由病理科診斷、存檔并提供。研究項目經(jīng)秦皇島市第一醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會(倫理編號：2017B018)批準(立項編號：20181185)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

NSCLC A549細胞購置于中科院上海細胞庫，采用體積分數(shù)10% FBS(美國Gibco公司)、1%青-鏈霉素的1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。體外實驗分組為：①對照組：體積分數(shù)為0.5% FBS的1640培養(yǎng)基；②TGF-β1誘導組：0.5% FBS 1640 + 5 ng/mL TGF-β1(美國Peprotech公司)；③HDAC6抑制劑組：0.5% FBS 1640 + 5 ng/mL TGF-β1+10-6mol/L TCS HDAC6 20b(英國Tocris公司)；④ROCK抑制劑組：0.5%FBS 1640+5 ng/mL TGF-β1+10-3mol/L Y-27632(美國Cayman公司)；⑤ERK抑制劑組：0.5% FBS 1640 + 5 ng/mL TGF-β1 + 10-6mol/L PD98059(美國Cayman公司)。TCS HDAC6 20b、Y-27632和PD98059預誘導1 h后，再加入TGF-β1共誘導24 h。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖

調(diào)整細胞密度為每孔1×104種植于96孔板，次融合后同步化24 h，按照實驗設(shè)計分組(每組10孔)，24 h后加入每孔10 μL CCK-8(碧云天)，37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，酶標儀450 nm測定OD值。

1.2.3 免疫組織/細胞化學染色

常規(guī)石蠟包埋切片；按照文獻方法制備細胞爬片，按實驗設(shè)計分組，24 h后4%多聚甲醛固定1 h。采用枸鹽酸高壓修復，一抗E-cadherin(北京中杉金橋)、HDAC6(美國Abcam公司)、α-SMA(美國Abcam公司)4℃過夜(濃度為1∶100)，按照免疫組化試劑盒說明書(PV-6000，北京中杉金橋)進行，DAB顯色，蘇木素輕度復染，中性樹膠封片。臨床樣本檢測中，HDAC6定位于胞漿內(nèi)，E-cadherin定位于細胞膜，表達棕黃色。

1.2.4 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力

按照每孔2×105的細胞密度接種于24孔板，用10%的胎牛血清的1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。當細胞次融合時，在單層培養(yǎng)細胞上，用200 μL槍頭沿培養(yǎng)板底部呈“一”字形劃痕，鏡下記錄劃痕區(qū)相對距離，然后按照實驗設(shè)計更換培養(yǎng)基，每組設(shè)4個復孔，48 h后倒置顯微鏡下觀察細胞向劃痕區(qū)遷移并拍照，用IPP 6.0圖像分析軟件測量劃痕區(qū)面積，計算遷移率(1～48 h劃痕區(qū)面積/0 h劃痕區(qū)面積)×100%作為細胞遷移能力的指標，遷移率越高代表遷移能力越強。

1.2.5 基質(zhì)膠侵襲實驗檢測侵襲能力

收集細胞，離心重懸調(diào)整細胞密度為1×105/mL，在transwell小室上層加入200 μL單細胞懸液，下室沿側(cè)壁加入600 μL含10% FBS的1640培養(yǎng)基。37℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。取出小室，小心去除濾膜表面未穿膜的腫瘤細胞。95%酒精固定，吉姆薩染色。鏡下計數(shù)侵襲細胞數(shù)，取5個視野的平均值。以侵襲細胞的相對數(shù)目反映細胞的侵襲能力。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達

RIPA裂解細胞，收集上清12 000 r/min離心15 min，收集上清，分裝冰凍保存。Brafford法測定蛋白濃度，按30～50 μg蛋白/泳道上樣并常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜，一抗E-cadherin、HDAC6)、α-SMA和vimentin(美國Abcam公司)4℃過夜，二抗1∶3000(美國KPL公司)37℃孵育1 h，ECL發(fā)光(美國GE公司)并掃描。采用Image Lab圖像分析軟件測定條帶的OD值，以目的蛋白與內(nèi)參的比值作為該蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 HDAC6和E-cadherin在NSCLC組織表達的臨床意義

如圖1所示，HDAC6在肺組織中主要表達于細胞漿，可見細胞核表達；E-cadherin則陽性表達于細胞膜。HDAC6在NSCLC組織中陽性表達率為71.15%(37/52)，顯著高于癌旁組的11.54%(6/52)，經(jīng)χ2檢驗，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=38.103；P<0.001)；E-cadherin在NSCLC組織中陽性表達率為28.85%(15/52)，顯著低于癌旁組的80.77%(42/52)，經(jīng)χ2檢驗，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=28.300；P<0.001),見表2。

如表1所示，HDAC6蛋白在NSCLC中的表達與患者性別、年齡、腫瘤大小、組織學類型和臨床分期等因素無關(guān)(P>0.05)，而與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。E-cadherin在NSCLC中的表達與患者性別、年齡、腫瘤大小、組織學類型、分化程度、臨床病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素無關(guān)(P>0.05)。在NSCLC組織中，HDAC6陽性表達與E-cadherin陽性表達呈負相關(guān)(r=-0.532；P<0.001)，見表2。

表 1 HDAC6和E-cadherin在NSCLC中表達的臨床意義

表 2 HDAC6和E-cadherin在NSCLC中表達的相關(guān)性分析

圖1 HDAC6和E-cadherin在NSCLC中的表達(免疫組織化學染色，×400)Figure 1 The positive expression of HDAC6 and E-cadherin in NSCLC tissues. IHC staining

2.2 抑制HDAC6能夠抑制A549細胞增殖

CCK-8結(jié)果顯示，TGF-β1誘導能夠顯著促進細胞增殖，其OD值為(2.191 ± 0.045)，是對照組(0.649 ± 0.126)的3.38倍，而予以TCS HDAC6 20b、Y-27632和PD98059能夠顯著抑制TGF-β1誘導的細胞增殖，其OD值(1.274 ± 0.191；1.197 ± 0.083；1.194 ± 0.157)分別為TGF-β1誘導組的58.15%、54.63%和54.49%，經(jīng)方差分析(F=90.287)，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

如圖2所示，免疫組織化學染色結(jié)果顯示HDAC6在A549細胞中胞漿內(nèi)陽性表達，在TGF-β1誘導組中陽性表達上調(diào)，予以HDAC6特異性抑制劑及ROCK、ERK1/2信號抑制劑能夠顯著抑制其陽性表達；及免疫印跡結(jié)果顯示，予以TGF-β1誘導后，HDAC6表達水平上調(diào)，是對照組的3.18倍，而給予HDAC6特異性抑制劑及ROCK、ERK1/2信號抑制劑后，均能夠顯著抑制HDAC6蛋白的表達，分別是TGF-β1誘導組的68.52%、57.41%和77.78%，經(jīng)方差分析(F=20.927)，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

2.3 抑制HDAC6能夠抑制A549細胞的遷移和侵襲

劃痕實驗結(jié)果如圖3顯示，TGF-β1能夠顯著誘導A549細胞遷移，遷移率為(72.50 ± 6.45)%，顯著高于對照組的(34.50 ± 3.11)%，而在HDAC6抑制劑、ROCK和ERK1/2抑制劑組中，與TGF-β1誘導組相比，遷移率明顯下降，經(jīng)方差分析(F=25.845)，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

通過Transwell小室侵襲實驗，檢測對照組、TGF-β1誘導組、HDAC6 20b組、Y-27632組和PD98059組的細胞侵襲能力，顯微鏡下計數(shù)侵襲細胞數(shù)，分別為(57.50 ± 21.39)、(260.50 ± 70.09)、(110.25 ± 29.55)、(127.50 ± 42.91)和(148.25 ± 15.19)。予以HDAC6、ROCK和ERK抑制劑后均能夠顯著抑制TGF-β1誘導的細胞侵襲能力的提高，經(jīng)方差分析(F=13.486)，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

注：C：對照組；T：TGF-β1誘導組；H：HDAC6抑制劑組；Y：ROCK抑制劑組；P：ERK抑制劑組。與對照組相比較，*P<0.05；與TGF-β1誘導組相比較；#P <0.05。圖2 HDAC6在TGF-β1介導的A549細胞發(fā)生EMT中的調(diào)節(jié)作用Note. C, control group; T, TGF-β1; H, HDAC6 20b; Y, Y-27632; P, PD98059. Compared with the control group, *P<0.05. Compared with the TGF-β1 group, #P<0.05.Figure 2 The role of HDAC6 in regulation of EMT in A549 cells induced by TGF-β1

注：C：對照組；T：TGF-β1誘導組；H：HDAC6抑制劑組；Y：ROCK抑制劑組；P：ERK抑制劑組。與對照組相比較，*P<0.05；與TGF-β1誘導組相比較；#P <0.05。圖3 HDAC6抑制劑對TGF-β1介導的A549細胞遷移和侵襲能力的影響Note. C, control group; T, TGF-β1; H, HDAC6 20b; Y, Y-27632; P: PD98059. Compared with the control group, *P<0.05. Compared with the TGF-β1 group, #P<0.05.Figure 3 The effect of HDAC6 inhibitor on migration and invasion of A549 cells induced by TGF-β1

2.4 抑制HDAC6能夠抑制A549細胞發(fā)生EMT

予以TGF-β1誘導，A549細胞出現(xiàn)典型的形態(tài)學改變，由原有“鋪路石”樣轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形，細胞連接消失，細胞間隙增大。免疫細胞化學染色結(jié)果如圖4顯示，TGF-β1誘導后，A549細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)α-SMA陽性表達的肌絲樣結(jié)構(gòu)，而予以TCS HDAC6 20b、Y-27632和PD98059后，α-SMA陽性表達明顯減弱。免疫印跡結(jié)果顯示，TGF-β1能夠顯著誘導α-SMA和vimentin的蛋白表達，分別是對照組的1.79倍、12倍，同時抑制E-cadherin的蛋白表達下調(diào)，是對照組的25.00%，而予以HDAC6、ROCK和ERK抑制劑后，能夠顯著抑制上述變化。經(jīng)方差分析(F=5.502；F=13.313；F=28.459)，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

注：C：對照組；T：TGF-β1誘導組；H：HDAC6抑制劑組；Y：ROCK抑制劑組；P：ERK抑制劑組。與對照組相比較，*P<0.05；與TGF-β1誘導組相比較；#P <0.05。圖4 HDAC6抑制劑對TGF-β1介導的A549細胞EMT的調(diào)節(jié)作用Note. C, control group; T, TGF-β1; H, HDAC6 20b; Y, Y-27632; P, PD98059. Compared with the control group, *P<0.05. Compared with the TGF-β1 group, #P<0.05.Figure 4 The effect of HDAC6 inhibitor on EMT of A549 cells induced by TGF-β1

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，HDAC6在NSCLC臨床樣本中高表達，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和臨床分期關(guān)系密切，且與E-cadherin的表達呈負相關(guān)，提示HDAC6可能參與了NSCLC的發(fā)生、發(fā)展，并與EMT具有一定的關(guān)系。體外研究也顯示，在TGF-β1誘導的A549細胞發(fā)生EMT的過程中，HDAC6高表達并伴隨著間質(zhì)細胞表型α-SMA和vimentin表達的上調(diào)，E-cadherin表達下調(diào)，同時細胞增殖、遷移和侵襲的能力增加，與ROCK和ERK1/2信號的活化有關(guān)。

以往研究發(fā)現(xiàn)，HDAC6可能是腫瘤潛在的治療靶點之一。在乳腺癌患者的臨床樣本中，可觀察到HDAC6蛋白水平的高表達，同時HDAC6蛋白高表達與組織學類型、p53過表達關(guān)系密切，且多提示預后不良[8]。綠原酸(chlorogenic acid, CGA)能夠通過抑制HDAC6的作用，從而抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP-2)的表達和細胞增殖能力，在體內(nèi)外能夠顯著抑制A549細胞的成瘤活性[9]。在本研究中，也發(fā)現(xiàn)HDAC6高表達于NSCLC，并與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期關(guān)系密切。其表達多于NSCLC細胞胞漿內(nèi)，可見核內(nèi)表達，由于樣本例數(shù)較少且缺乏定量分析手段，且相關(guān)文獻報道較少，課題組未對其核/漿表達進行具體分析，是本研究的缺陷之一。但綜合文獻支持，HDAC6與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系較為密切，可能與EMT的發(fā)生有關(guān)。

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，EMT是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移、腫瘤耐藥性和腫瘤干細胞形成的重要機制[1]。TGF-β1誘導的A549細胞發(fā)生EMT是較為經(jīng)典的體外EMT模型[10]，形態(tài)上上皮細胞失去極性、細胞間粘附，表現(xiàn)在上皮標記物E-cadherin、ZO-1、黏著斑蛋白表達的缺失，同時間質(zhì)表型vimentin、α-SMA表達上調(diào)，并伴有張力纖維的形成，使細胞獲得遷移、侵襲的能力，同時耐受凋亡的能力增加[11]。在本研究中也發(fā)現(xiàn)，予以TGF-β1誘導后，A549細胞由原有鋪路石狀轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形、紡錘形，同時細胞間隙增大，E-cadherin表達下調(diào)，而vimentin和α-SMA表達上調(diào)，同時伴有細胞增殖、遷移和侵襲能力的增加。而予以HDAC6特異性抑制劑TCS HDAC6 20b后，能夠顯著抑制該變化，提示HDAC6可能在NSCLC的EMT進程中起到了重要的調(diào)控作用。

在本研究中，采用ERK1/2和ROCK抑制劑也能夠觀察到對TGF-β1介導的A549細胞發(fā)生EMT的抑制作用，并與HDAC6的失活有關(guān)。ROCK信號的活化，能夠磷酸化失活微管多聚化促進蛋白1(tubulin polymerization promoting protein 1, TPPP1)，從而抑制TPPP1對HDAC6的抑制作用，進而促進腫瘤細胞的遷移和侵襲[6]，同時能夠影響細胞周期蛋白從而促進腫瘤細胞的增殖[12-13]。而ERK1/2信號的活化能夠磷酸化HDAC6 1035位點，并促進細胞運動能力的提高，反過來HDAC6也能夠激活ERK1/2信號促進腫瘤細胞的生長[7,14]。結(jié)合本研究結(jié)果，提示針對ERK1/2和ROCK信號的阻斷，能夠通過對HDAC6的調(diào)節(jié)，阻斷A549細胞的EMT的發(fā)生，抑制細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。