解一舟，李玉珍，朱 慧，史英翔，金 劍，李宏強*

(1.北京建生藥業(yè)有限公司，北京 100039； 2.鄭州大學第三附屬醫(yī)院，鄭州 450052)

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，大量統(tǒng)計數(shù)據(jù)或研究資料表明，其發(fā)病率占全部顱內(nèi)腫瘤的70%以上[1]，其惡性程度高，患者的生存率極低[2]，目前的常規(guī)治療模式有手術(shù)切除、放療及化療[3]，然而由于其浸潤性生長的生物學特點[4]，手術(shù)難以徹底清除，常規(guī)放、化療的毒副反應也一直是困擾醫(yī)療界的難題[5]，目前國內(nèi)外還沒有真正意義上的可以有效控制或治療腦膠質(zhì)瘤的方法[6]，開發(fā)出高效低毒的創(chuàng)新型藥物，無疑將會打破腦膠質(zhì)瘤治療的僵局[7]。中藥具有多成分、多靶點、低毒性的特點[8]，采用新鮮的中藥治愈疾病作為一種獨特的中醫(yī)治療方法在中國具有悠久的歷史，隨著科學技術(shù)的發(fā)展，新鮮的傳統(tǒng)醫(yī)藥相繼問世，這種鮮中藥又稱為現(xiàn)代鮮藥，現(xiàn)代鮮藥以傳統(tǒng)中醫(yī)理論為基礎，采用鮮活動、植物體為原料，運用低溫冷凍現(xiàn)代生化分離提取技術(shù)，研制出保持鮮藥特色的創(chuàng)新鮮藥制劑，其質(zhì)量穩(wěn)定、可控[9]。金龍膠囊，即是以鮮動物藥為原料的現(xiàn)代鮮藥制劑，藥品上市以來對于金龍膠囊的臨床觀察已表明其對腦膠質(zhì)瘤生長具有明顯的抑制作用[10]，在此基礎上，本課題組進行了此項實驗，以明確金龍膠囊提取物及其所制備的粗多糖、粗蛋白對腦膠質(zhì)瘤的抗腫瘤作用，為后續(xù)探索金龍膠囊抗腦膠質(zhì)瘤作用的藥效物質(zhì)基礎提供了事實依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級BALB/c-nu 裸鼠100只，雌雄各半，體重(13.5±2.5)g，3～4周齡，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0004]，動物飼養(yǎng)及無菌手術(shù)于在安泰康生物技術(shù)(北京)有限公司SPF級動物房[SYXK(京)2014-0034]中進行，飼養(yǎng)環(huán)境定期清潔消毒，實驗過程符合倫理委員會要求[倫理審查證編號：ACB20180020]，并按實驗動物使用的 3R 原則給予人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U87-RFP由安泰康生物技術(shù)(北京)有限公司提供。

金龍膠囊提取物(多糖含量：9.04%，蛋白含量：15.39%，批號：20180423)、金龍粗多糖(多糖含量：19.40%，批號：20180605)、金龍粗蛋白(蛋白含量：74.86%，批號：20180703)均由北京建生藥業(yè)有限公司提供。金龍膠囊提取物是按照金龍膠囊成藥工藝制備而成的不含輔料的凍干粉，金龍粗多糖是由金龍?zhí)崛∥锝?jīng)醇沉、酶解、透析的方法制備，金龍粗蛋白是由金龍?zhí)崛∥锝?jīng)鹽析、透析的方法制備；替莫唑胺膠囊(蒂清，江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司，批號：201804082)。

FluorVivo Model 100熒光小動物活體成像儀(INDEC BioSystems, CA, USA)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型建立

3～4周齡的BALB/c-nu小鼠，100只，雌雄各半，其中按照隨機數(shù)字表隨機選出10只用作空白對照，雌雄各半。剩余小鼠應用外科原位移植方法，取源自同系小鼠皮下的U87-RFP腫瘤組織，在解剖顯微鏡下切除壞死的組織并將腫瘤組織切成1 mm3大小均一的組織塊，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，將麻醉的裸鼠固定在小鼠腦立體定向儀上，酒精消毒后延矢狀縫剪開頭皮1 cm，在矢狀縫和冠狀縫焦點(前囟)偏右3 mm，靠上1 mm處(定位于尾狀核)鉆骨窗，直徑約0.5 mm，無菌手術(shù)條件下，運用外科原位接種(surgical orthotopic implantation)技術(shù)，將切好的腫瘤組織塊種植到實驗小鼠顱內(nèi)，并用6-0外科縫合線縫合小鼠皮膚，建立紅色熒光蛋白標記的人類腦膠質(zhì)瘤(U87-RFP)小鼠原位模型[11]。U87-RFP細胞是用逆轉(zhuǎn)錄病毒方法進行轉(zhuǎn)染，具體方法如下：逆轉(zhuǎn)錄表達載體pLNCX2(購自Clontech Laboratories, Inc.，G418抗性)連接pDsRed2片段(購自Clontech Laboratories, Inc.)，用PT67細胞(購自Clontech Laboratories, Inc.)進行包裝。U87細胞培養(yǎng)至對數(shù)期，加入預先過濾(0.22 μm)的PT-67 RFP細胞上清，共培養(yǎng)48 h，熒光顯微鏡下觀察紅色熒光，200～1000 μg/mL G418篩選1周，進行單克隆培養(yǎng)，篩選熒光明亮的克隆進行培養(yǎng)。逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染是一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，直接將外源基因整合到宿主的基因組中，具有穩(wěn)定遺傳性，篩出表達熒光的細胞株后，熒光強度不會衰減[12]。

1.3.2 小鼠原位模型評價

模型建立后第3天，用FluorVivo Model 100熒光成像儀對所有模型小鼠的腦腫瘤進行非侵襲性的實時成像觀察，觀察到紅色熒光蛋白標記的腫瘤的模型即為建模成功。

1.3.3 分組及給藥

通過FluorVivo Model 100成像儀觀察成像情況，讀取腫瘤熒光面積并記錄，剔除模型中腫瘤熒光面積偏離均值較大的荷瘤小鼠后，將挑選出的70只小鼠按照隨機數(shù)字表隨機分為7組(10只/組)，雌雄各半。陽性對照組每天灌胃給與替莫唑胺膠囊內(nèi)容物，給藥劑量為32 mg/kg；金龍膠囊粗多糖組、金龍膠囊粗蛋白組每天灌胃給予粗多糖、粗蛋白，給藥劑量均為100 mg/kg；金龍膠囊提取物低、中、高劑量組每天灌胃給予金龍膠囊提取物，給藥劑量分別為750 mg/kg、1200 mg/kg、1500 mg/kg；空白對照組及陰性對照組每天給予同體積的溶媒(純凈水)，給藥時間為25 d。

1.3.4 定期觀察實驗動物

在實驗過程中，每天觀察動物的狀況，動物體重每周稱量2次，每周兩次通過FluorVivo Model 100成像儀觀察實驗小鼠的腫瘤熒光成像情況并讀取成像面積，具體方法為在開機狀態(tài)下打開成像小室的門，實驗員用左手抓住小鼠耳朵，右手抓住小鼠雙腳，置于成像小室的特定位置，通過FluorVivo Model 100成像儀拍照，然后將小鼠放回籠內(nèi)。系統(tǒng)拍攝的照片通過系統(tǒng)自帶軟件FluorVivoTM成像與分析軟件自動計算腫瘤熒光面積。

給藥25 d后，所有的裸鼠均通過注射常規(guī)麻醉藥4倍劑量處死，通過FluorVivo Model 100成像儀和Leica MZ16熒光顯微鏡觀察實驗小鼠的腫瘤負荷情況和腫瘤的轉(zhuǎn)移情況，采集所有荷瘤小鼠的腫瘤均分成3份，一份福爾馬林固定，2份存于液氮中并對腫瘤進行稱重和記錄。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 實驗動物的一般狀況

注：與空白對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與陰性對照組比較，##P< 0.01。圖1 小鼠體重生長曲線Note. Compared with the blank control group, *P< 0.05, **P< 0.01. Compared with the negative control group, ##P< 0.01.Figure 1 Body weight curves of the mice

小鼠經(jīng)灌胃投予藥物后，無臥伏，自主活動減少等現(xiàn)象。如圖1所示，與空白對照組比較，陰性對照組和各治療組小鼠體重均有不同程度的降低，差異具有顯著性；替莫唑胺治療組體重增長幅度最小，與空白對照組、陰性對照組相比有極其顯著的差異；金龍膠囊各治療組體重雖略低于陰性對照組，但與陰性對照組相比，差異均無顯著性。

圖2 各實驗組1 d、11 d、25 d 的在體腫瘤整體原位熒光成像圖Figure 2 Whole-body fluorescence images of the tumors in each test group on the 1st day, 11th day and 25th day

組別Groups1 d平均腫瘤面積(mm2)Average tumor-size on 1st day25 d平均腫瘤面積(mm2)Average tumor-size on 25th day陰性對照組(溶媒)Negative control group (solvent)0.74±0.4149.52±20.65陽性對照組(替莫唑胺)Positive control group(temozolomide)0.90±0.181.55±1.08**金龍膠囊粗多糖組JLC crude polysaccharides group1.01±0.3943.05±8.16金龍膠囊粗蛋白組JLC crude proteins group0.79±0.4234.32±6.56金龍膠囊提取物低劑量組JLC extract low-dose group0.81±0.3838.48±10.23金龍膠囊提取物中劑量組JLC extract medium-dose group0.74±0.3037.11±11.59金龍膠囊提取物高劑量JLC extract high-dose group0.69±0.3833.60±10.34*

注：與陰性對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the negative control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

2.2 金龍膠囊對小鼠原位腦腫瘤的作用

如圖3和表1所示，實驗結(jié)束時，替莫唑胺組腫瘤熒光面積讀數(shù)明顯小于陰性對照組，差異有顯著性；金龍膠囊粗多糖組、粗蛋白組腫瘤熒光面積讀數(shù)與陰性對照組相較略有縮小(減少13.06%，30.69%)，差異無顯著性；金龍膠囊提取物低、中、高劑量組腫瘤熒光面積讀數(shù)較分別較陰性對照組減少22.30%，25.06%和32.15%。但低、中劑量組與陰性對照組之間差異均無顯著性，高劑量金龍?zhí)崛∥飳π∈笤荒Ｐ湍[瘤抑制作用差異有顯著性。

2.3 各組實驗驗動物的腫瘤負荷

如表2示，實驗結(jié)束后，替莫唑胺組腫瘤平均重量僅為陰性對照組的0.43%，并具有統(tǒng)計學意義上的顯著差異；金龍膠囊粗多糖組、金龍膠囊粗蛋白組腫瘤平均重量約為陰性對照組的77.06%、62.34%，但與陰性對照組比較均不具有統(tǒng)計學意義上的顯著差異；金龍膠囊提取物低、中劑量組的平均瘤重分別約為陰性對照組平均瘤重的65.37%和65.37%，但與陰性對照組之間均無統(tǒng)計學差異；金龍膠囊提取物高劑量組的平均瘤重約為陰性對照組的38.10%，而且與陰性對照組組平均瘤重之間具有統(tǒng)計學意義上的顯著差異，如圖4(P< 0.05)。

注：與陰性對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。圖3 各組小鼠腦腫瘤熒光面積隨時間變化示意圖Note. Compared with the negative control group, *P< 0.05, **P< 0.01.Figure 3 Schematic diagram of fluorescence area of the brain tumors in each group over time

注：與陰性對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。圖4 金龍?zhí)崛∥锛捌涠嗵恰⒌鞍讓π∈竽X腫瘤的影響Note. Compared with the negative control group, *P< 0.05, **P< 0.01.Figure 4 Inhibiting effects of extracts of JLC and polysaccharides and proteins prepared from JLC extracts on brain tumors in the mice

表2 實驗各組腦腫瘤重量及腫瘤抑制率的比較

注：與陰性對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the negative control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

3 討論

本實驗中，不同劑量的金龍膠囊提取物均可抑制原位腦膠質(zhì)瘤的生長，以高劑量組(1500 mg/kg)腫瘤抑制率最為顯著。未發(fā)現(xiàn)金龍膠囊及其制備的粗多糖、粗蛋白有明顯的急性毒性反應。

腦膠質(zhì)瘤惡性度高，不易手術(shù)切除和放化療治療[13]，目前已有的治療藥物中，除替莫唑胺膠囊等化藥外，尚無作用明確的治療腦膠質(zhì)瘤的中成藥，臨床用藥費用昂貴，患者多采用姑息治療方式。腦膠質(zhì)瘤的動物模型[14]并不多，大多采用移植瘤的方法在小鼠腋下或皮下種植移植瘤細胞，觀察藥物對移植瘤的抑制作用。這種方法尚無法觀察藥物透過血腦屏障的作用，導致很多對移植瘤有效的藥物，由于無法或不易透過血腦屏障而無效或效果不顯著[9]。目前，有很多方法可以追蹤某一成分透過血腦屏障[15]的效果，中成藥具有多成分、多靶點的特點，故無法通過追蹤特定成分觀察透過血腦屏障的作用。因此，建立原位腦腫瘤動物模型，比較藥物作用后的原位腦腫瘤的熒光面積的大小，可以間接反映藥物透過血腦屏障作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的效果?；铙w成像技術(shù)可以有效解決顱內(nèi)腫瘤因被頭蓋骨遮擋無法直接觀察及測量的難題，通過紅色熒光蛋白標記的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U87-RFP細胞，再將轉(zhuǎn)染后的U87-RFP細胞注入顱內(nèi)建立原位腦腫瘤模型，利用活體成像技術(shù)可以直接觀察到紅色熒光標記的腫瘤的大小并通過相應的軟件計算熒光面積。本研究通過該方法，可以觀察到替莫唑胺膠囊具有良好的抗腫瘤效果，但同時也具有極其顯著的毒副作用，小鼠體重增長率顯著降低。金龍膠囊提取物對小鼠腦膠質(zhì)瘤的抑制作用，也在一定程度上吻合了臨床上金龍膠囊對腦膠質(zhì)瘤患者的治療作用[16]。同時實驗中，尚未發(fā)現(xiàn)及其制備的粗多糖、粗蛋白有明顯的急性毒性反應，說明金龍膠囊的安全性良好。上述研究也初步證實了金龍?zhí)崛∥锒嗵?、金龍?zhí)崛∥锏鞍自诳鼓X膠質(zhì)瘤方面的積極作用，從藥效學動物模型的角度證實了金龍?zhí)崛∥锒嗵羌暗鞍拙煽缪X屏障轉(zhuǎn)運并作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，為后續(xù)金龍膠囊抗腦腫瘤藥效物質(zhì)基礎的研究奠定了實驗基礎，也為以后將多糖含量測定納入金龍膠囊質(zhì)量標準提供了依據(jù)?？诜苿┯捎谖改c道的消化作用、肝臟的消除作用等，有效物質(zhì)能被吸收入血并經(jīng)多種途徑跨血腦屏障作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的量往往較少[17]，但也可以起到一定的積極作用，基于本次研究，發(fā)現(xiàn)金龍膠囊中的多糖及蛋白組份在抗腦膠質(zhì)瘤方面有很大的潛力和研究意義，如能進一步揭示多糖及蛋白組分的作用機制，一方面能更好的解釋金龍膠囊抗腦膠質(zhì)瘤的作用特點，初步確認金龍膠囊抗腦膠質(zhì)瘤作用的物質(zhì)基礎，另一方面也可以為開發(fā)高效、低毒的新型藥物制劑提供理論、實驗基礎及事實依據(jù)。