叢日旭，佟 巍，向志光，張麗芳，劉先菊，阮研碩，郭 智，劉云波

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京 100021)

基因修飾大小鼠對(duì)生物醫(yī)學(xué)做出了巨大貢獻(xiàn)。由于靈長(zhǎng)類動(dòng)物和嚙齒類動(dòng)物之間的神經(jīng)生理功能、代謝途徑和藥物敏感性等遺傳和生理差異，阻礙了從大小鼠疾病模型中的結(jié)果直接應(yīng)用于人類臨床[1]?；蛐揎楈`長(zhǎng)類動(dòng)物疾病模型在人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中，發(fā)揮著更為重要作用[2-3]。普通狨猴(common marmoset，Callithrixjacchus)是一種新世界靈長(zhǎng)類動(dòng)物，與恒河猴相比，雖與人類的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但它們具有多胎(每胎2～4只)、妊娠期較短(約144 d)、全年發(fā)情等特性[4-5]等，生殖特性，利用這種特性可以種系傳播的轉(zhuǎn)基因狨猴已經(jīng)被報(bào)道[6-7]，狨猴作為人類疾病的基因修飾靈長(zhǎng)類模型有獨(dú)特的價(jià)值。

由于非靈長(zhǎng)類動(dòng)物基因修飾較大小鼠相比、胚胎難以獲得且數(shù)量有限，生殖周期較長(zhǎng)，生育數(shù)量少，基因組更復(fù)雜等因素的限制[8-9]，選擇編輯效率高的基因修飾技術(shù)和活性高sgRNA靶點(diǎn)顯著提高基因修飾效率。CRISPR/Cas9系統(tǒng)因其系統(tǒng)成分簡(jiǎn)單、操作方便、突變效率高、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，已成為現(xiàn)在發(fā)展最為迅速、國內(nèi)外學(xué)者廣泛研究開發(fā)、應(yīng)用于多種生物體基因組的定向基因編輯技術(shù)[10]。普通狨猴在我國是一種較新的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其相關(guān)細(xì)胞系較少。為了獲得可用于sgRNA篩選的細(xì)胞，本文建立狨猴腎臟細(xì)胞培養(yǎng)體系，及細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)染，抗性篩選體系，將含有sgRNA與Cas9質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入狨猴細(xì)胞，檢測(cè)sgRNA靶點(diǎn)的活性及基因編輯效率，為基因修飾狨猴模型的構(gòu)建的基因修飾靶點(diǎn)的篩選提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通狨猴1只，雄性，體重280 g，27月齡，普通環(huán)境飼養(yǎng)，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，生產(chǎn)許可證號(hào)[SCXK(京)2014-0011]，使用許可證號(hào)[SYXK(京)2017-0027]，本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查，符合3R原則，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)號(hào)：LYB18003。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM/F12培養(yǎng)基(11330032, Gibco)，RPMI1640培養(yǎng)基(11875093, Gibco)，胎牛血清(10099141，Gibco)，0.25%胰酶-EDTA(25200056, Gibco)，青霉素鏈霉素溶液雙抗(SV30010，HyClone)，二甲基亞砜DMSO(D2650，Sigma),嘌呤霉素(P8833，Sigma)，殺稻瘟菌素(15205，Sigma)，胰島素(I5500，Sigma)，轉(zhuǎn)鐵蛋白(T0665，Sigma)，地塞米松(D4902，Sigma)，ViaFectTM Transfection Reagent (E4982, Promega)。CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo)，離心機(jī)(Multifuge 1S-R, Thermo)，電熱恒溫水浴鍋(SSW-600-2S，上海博源實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，倒置顯微鏡及成像(CF-2098,長(zhǎng)方)，PCR儀(T100, Bio-Rad)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 狨猴腎臟原代細(xì)胞培養(yǎng)

培養(yǎng)液Ⅰ：RPMI1640+10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)+1%雙抗;

培養(yǎng)液Ⅱ：DMEM/F12+10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)+1%雙抗;

兩種培養(yǎng)中分別加入10 μg/mL胰島素，5.5 μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白和40 ng/mL地塞米松，促進(jìn)原代細(xì)胞增殖。

無菌操作摘除狨猴腎臟組織。去除腎臟上的脂肪和腎包膜， PBS沖洗并將其剪成1 mm3的碎塊，洗滌3次。

(一)貼壁組織塊法[11]：1 mm3組織小塊擺放在培養(yǎng)瓶底，輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，瓶底朝上，加入培養(yǎng)液Ⅰ 5 mL。置于 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h左右，緩慢翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使液體緩緩覆蓋組織塊。

(二)消化法[12]，離心管加入約4倍量的0.25%胰酶-EDTA，放置在 37℃ 電熱恒溫水浴鍋中消化，每5 min搖動(dòng)1次，30 min后，去除組織塊，加入培養(yǎng)液Ⅰ終止消化。細(xì)胞懸液以800 r/min低速離心 10 min，棄上清液，加培養(yǎng)液Ⅰ輕輕吹打形成細(xì)胞懸液，置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)液Ⅰ5 mL。

37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；48 h后觀察細(xì)胞遷出情況，拍照并按1/3～1/2換液量更換培養(yǎng)基。

1.3.2 傳代培養(yǎng)

當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到細(xì)胞瓶底70%～80%左右時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細(xì)胞細(xì)化程度，以細(xì)胞變圓不連接成片為標(biāo)準(zhǔn)，時(shí)間2～3 min左右，吸去消化液，加入培養(yǎng)液終止消化并吹打，按照1∶3。

1.3.3 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定與繪制

細(xì)胞計(jì)數(shù)：吸取500 μL 細(xì)胞懸液加入臺(tái)盼藍(lán)(0.4%)，并吹打均勻。然后吸取10 μL沿著邊緣緩緩滴入一次性細(xì)胞計(jì)數(shù)板，保證計(jì)數(shù)板充滿懸液，不留氣泡。對(duì)9個(gè)大格中沒有被染液染色(活)的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。細(xì)胞數(shù)量計(jì)算如下：

n=N/3×106

式中n表示每毫升細(xì)胞懸液中的活細(xì)胞數(shù)，N表示計(jì)數(shù)板4個(gè)大格子的活細(xì)胞數(shù)。

1.3.4 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

冷凍保存：用0.25%胰酶-EDTA消化細(xì)胞，培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞至離心管，800 r/min，10 min，棄上清。用冷凍液(90% FBS + 10% DMSO)，重懸，將冷凍管放入程序降溫盒內(nèi)，放在-70℃冰箱暫存，置于液氮中長(zhǎng)期保存。

解凍復(fù)蘇：從-70℃冰箱取出冷凍管，移入37℃水浴鍋內(nèi)，并搖晃明至完全解凍。時(shí)間不超過3 min。取少量進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。800 r/min離心，10 min，傾棄上清，徹底去除保護(hù)劑，再往加入培養(yǎng)液，充分混懸后分瓶培養(yǎng)。

1.3.5 藥物抗性篩選與轉(zhuǎn)染

消化狨猴腎臟細(xì)胞至6孔板，第2天更換培養(yǎng)基，將1 mg/mL的連接有GFP的質(zhì)粒3 μL與ViaFectTMTransfection Reagent和Lipo2000，按照1∶3的進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h后，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。

消化狨猴腎臟細(xì)胞至24孔板，第二天加入藥物，殺稻瘟菌素+嘌呤霉素：(0+0)、(1+0.5)、(2+1)、(4+2)、(8+4)、(10+5) μg/mL，觀察48 ～72 h，每個(gè)濃度3個(gè)孔，細(xì)胞死亡數(shù)在90%左右，定為藥物篩選終濃度。

1.3.6 CRISPR-Cas9在狨猴原代腎臟細(xì)胞的應(yīng)用研究

選擇狨猴SIRT1基因的第五個(gè)外顯子的兩個(gè)靶點(diǎn):A1 (GAACATAGACACGCTGGAACAGG)和A2(GACACGCTGGAACAGGTTGCAGG)進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建，將 sgRNA(pGL-U6-gRNA-Puromycin)和 cas9(pST1374-flag-linker-Cas9)質(zhì)粒各1 μg/mL，同時(shí)轉(zhuǎn)入狨猴F3腎臟細(xì)胞， 8 μg/mL的 Blasticidin(殺稻瘟菌素)和 4 μg /mlpuromycin(嘌呤霉素)抗性篩選，2 周后鹽析法提取細(xì)胞基因組，擴(kuò)包含 sgRNA結(jié)合位點(diǎn)的片段，測(cè)序驗(yàn)證靶點(diǎn)處是否引入突變。

1.4 數(shù)據(jù)與圖片

生長(zhǎng)曲線數(shù)據(jù)處理軟件為Graph Pad，圖像處理軟件為Image J。

2 結(jié)果

2.1 原代腎臟細(xì)胞培養(yǎng)

對(duì)腎細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后可明顯看出在貼壁的組織塊及消化的團(tuán)塊周邊緣遷出較透明的細(xì)胞 (圖1a和1b)。更換培養(yǎng)基后再培養(yǎng)5～6 d，可以看到有更多的細(xì)胞團(tuán)從組織塊邊緣脫落。經(jīng)7 d的培養(yǎng)，大多數(shù)組織塊周圍遷出的細(xì)胞單層。胰酶消化法由于細(xì)胞分散細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，單層細(xì)胞占培養(yǎng)瓶面積>70%，組織塊貼壁法培養(yǎng)的細(xì)胞由于組織塊脫落細(xì)胞遷出慢，單層細(xì)胞<50%(圖1c和1 d)。培養(yǎng)基中腎細(xì)胞多為圓形或梭形，為致密的單層細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)表明，RPMI1640培養(yǎng)液可以用于腎臟細(xì)胞的原代培養(yǎng)。組織貼壁法與胰酶消化法均可得到原代培養(yǎng)的細(xì)胞，相比較之下，胰酶消化法獲得細(xì)胞比組織塊貼壁法獲得細(xì)胞生長(zhǎng)速度快。

注：a：48 h后，組織貼壁法培養(yǎng)的腎臟細(xì)胞；b：48 h后，胰酶消化法培養(yǎng)的腎臟細(xì)胞；c：7 d后，組織貼壁法培養(yǎng)的腎臟細(xì)胞；d：7 d后，胰酶消化法培養(yǎng)的腎臟細(xì)胞。圖1 RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)狨猴腎臟原代細(xì)胞(×40)Note. a， Kidney cells by adhesive culture for 48 h. b， Kidney cells obtained by trypsin digestion, cultured after 48 h. c， Kidney cells by adhesive culture for 7 d. d, Kidney cells obtained by trypsin digestion, cultured after 7 d.Figure 1 The primary culture of marmoset kidney cells in RPMI1640 medium

2.2 腎臟細(xì)胞培養(yǎng)傳代

狨猴腎細(xì)胞傳代后培養(yǎng)大約3～4 d可長(zhǎng)成單層細(xì)胞，為梭形，胞膜完整清晰，胞質(zhì)明亮 (圖2a)。培養(yǎng)液Ⅰ(RPMI 1640)傳代培養(yǎng)至第4代時(shí)，細(xì)胞排列較疏松，細(xì)胞多呈圓形，細(xì)胞形態(tài)改變，胞膜邊緣較清晰。細(xì)胞出現(xiàn)衰老現(xiàn)象，在F1代更換，DMEM/F12培養(yǎng)液Ⅱ后，在第8代會(huì)出現(xiàn)類似的衰老現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)表明，在相同培養(yǎng)條件下，狨猴腎細(xì)胞在DMEM/F12培養(yǎng)基中生長(zhǎng)比RPMI 1640較好。由于本次實(shí)驗(yàn)取材的是成年狨猴腎臟，在本實(shí)驗(yàn)條件下能培養(yǎng)至第7代，細(xì)胞增殖能力有限，為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性，選取DMEM/F12培養(yǎng)基中生長(zhǎng)2～5代的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定與繪制

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板中每天取出3瓶孔細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算均值。培養(yǎng)3 d給未計(jì)數(shù)的細(xì)胞更換培液。以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸，繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。狨猴腎臟細(xì)胞生長(zhǎng)曲線中，在一定在時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)問的增加而增殖，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。其中0～1 d為潛伏期、1～3 d為細(xì)胞增殖期、3～5 d為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、5～7 d為平臺(tái)期(見圖3)。

注：a：F1代腎臟細(xì)胞；b：F4代腎臟細(xì)胞。圖2 RPMI1640培養(yǎng)不同代數(shù)狨猴腎臟細(xì)胞形態(tài)對(duì)比Note.a， The kidney cells of F1 generation. b， The kidney cells of F4 generation.Figure 2 Comparison of the morphology of marmoset kidney cells cultured in RPMI1640 medium.

圖3 狨猴腎臟細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(F3)Figure 3 Growth curve of the marmoset kidney cells (F3)

2.4 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

狨猴腎臟細(xì)胞復(fù)蘇后，進(jìn)行細(xì)胞的活力檢測(cè)(臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn))，復(fù)蘇成活率約為 70%～80%。證明狨猴腎臟細(xì)胞的生物學(xué)性狀穩(wěn)定，用90% FBS + 10% DMSO可成功凍存。

2.5 藥物抗性篩選與轉(zhuǎn)染

熒光顯微鏡觀察結(jié)果，ViaFect和Lipo2000相比，ViaFect的轉(zhuǎn)染率大于60%，明顯高于Lipo2000(如圖4)，但隨著細(xì)胞轉(zhuǎn)染率的增高，對(duì)細(xì)胞的毒性也會(huì)增大。細(xì)胞抗性篩選適宜濃度嘌呤霉素4 μg/mL，殺稻瘟菌素8 μg/mL。

注：a：ViaFect；b：Lipo2000。圖4 不同轉(zhuǎn)染試劑GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后絨猴腎臟細(xì)胞(F3)Figure 4 Marmoset kidney cells transfected with GFP plasmid (F3). a. ViaFect. b. Lipo2000.

2.6 CRISPR-Cas9在狨猴細(xì)胞的應(yīng)用研究

細(xì)胞DNA提取后，針對(duì)sgRNA靶點(diǎn)合成特異性引物F(GGCCAAGTTCGCTAATTGCTG)，R(GCAACGGCAACATCTTTGAA)，對(duì)基因組進(jìn)行擴(kuò)增(如圖5左)，兩組細(xì)胞均在目的擴(kuò)增600 bp處有明顯條帶，且單一，將PCR產(chǎn)物測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，SIRT1基因的兩個(gè)靶點(diǎn)，均從sgRNA的切割位點(diǎn)開始出現(xiàn)雜峰，證明了sgRNA成功地引入基因組突變(如圖5右)。Cas9可以用于狨猴腎臟細(xì)胞編輯。

3 討論

狨猴作為靈長(zhǎng)類動(dòng)物替代模型越來越多應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究，但狨猴相關(guān)細(xì)胞培系卻很少。在對(duì)狨猴各組織器官培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取細(xì)胞增殖快、細(xì)胞數(shù)量多的狨猴腎臟細(xì)胞作為目的細(xì)胞。哺乳動(dòng)物的腎臟有15～20多種細(xì)胞，如腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球毛細(xì)血管上皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞等[13]。本研究得到的腎臟細(xì)胞為多種細(xì)胞混合細(xì)胞，細(xì)胞均一性不好，但除了生殖細(xì)胞外每個(gè)細(xì)胞都有全部的遺傳信息，可以將CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)應(yīng)用培養(yǎng)的狨猴腎臟細(xì)胞。此外，腎臟細(xì)胞還可以應(yīng)用于生物制品的生產(chǎn)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的培養(yǎng)、藥物篩選、器官移植培養(yǎng)等方面[14-15]。

注：a：PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳(從左到右Marker，A1,A2)；b:SIRT1基因A1,A2位點(diǎn)與WT的測(cè)序結(jié)果。圖5 Cas9基因編輯技術(shù)在狨猴腎臟細(xì)胞的應(yīng)用Note. a, 1% agarose gel electrophoresis of the PCR products (from left to right: marker, A1, A2). b, Sequencing results of SIRT1 gene A1, A2 and WT loci.Figure 5 Application of Cas9 gene editing in the marmoset kidney cells

本研究進(jìn)行了狨猴腎臟的原代培養(yǎng)的研究，在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)7 d觀察組織貼壁法和胰酶消化法培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)與生長(zhǎng)速度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，組織塊貼壁法，對(duì)細(xì)胞的損傷較小，但由于細(xì)胞從組織塊遷出速度慢，使得細(xì)胞培養(yǎng)周期加長(zhǎng)。胰酶消化法可在短時(shí)間內(nèi)獲取大量單個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞增殖快，原代細(xì)胞培養(yǎng)的周期縮短(圖1)。選擇不同培養(yǎng)基培養(yǎng)狨猴腎臟細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，研究人員發(fā)現(xiàn)再添加同等劑量促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的血胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和地塞米松培養(yǎng)基，DMEM/F12比RPMI 1640更適合培養(yǎng)狨猴腎臟細(xì)胞。可能與兩種培養(yǎng)基中丙氨酸、半胱氨酸及鐵、鋅無機(jī)鹽及次黃嘌呤鈉、亞油酸、硫辛酸等的含量有關(guān)。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)染和抗性的篩選已經(jīng)成為研究和控制真核細(xì)胞基因功能的常規(guī)工具。本研究將帶有GFP的質(zhì)粒分別用實(shí)驗(yàn)室常用的兩種轉(zhuǎn)染試劑ViaFectTMTransfection Reagent和Lipo2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。結(jié)果表明，ViaFectTMTransfection Reagent轉(zhuǎn)染效率大于50%，明顯高于Lipo2000(圖4)，為保證細(xì)胞的活性，適當(dāng)降低轉(zhuǎn)染試劑的使用劑量，可以獲得更好的效果。與此同時(shí)，確定嘌呤霉素和殺稻瘟菌素兩種抗生素在抗性篩選時(shí)的使用的濃度分別為4 μg/mL、8 μg/mL。

本文以狨猴腎臟細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和篩選體系為基礎(chǔ)，選取了對(duì)代謝綜合征、細(xì)胞凋亡和神經(jīng)退行性疾病等發(fā)揮重要作用的SIRT1基因[15]的兩個(gè)位點(diǎn)，與Cas9一起轉(zhuǎn)染到狨猴腎臟細(xì)胞中，測(cè)序結(jié)果表明Cas9可以用于狨猴腎臟細(xì)胞編輯，狨猴腎臟細(xì)胞可以用于基因修飾靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型建立的基因靶點(diǎn)切割活性的篩選，同時(shí)也為狨猴腎臟細(xì)胞系的建立及永生化提供基礎(chǔ)。。