王思齊，包凱帆，王曉鈺，王霄彤，袁為遠，姚 露，許一凡，洪 敏

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室,科技部國家規(guī)范化中藥藥理實驗室， 南京 210023)

據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)調(diào)查，全世界范圍約有4億人患有過敏性鼻炎，3億人患有過敏性哮喘，每年平均有超過18萬人因哮喘而死亡[1]，這一數(shù)據(jù)每年有上升的趨勢，哮喘已成為世界醫(yī)學(xué)界公認為四大疾病之一。過敏性哮喘屬Ⅱ型免疫反應(yīng)導(dǎo)致的疾病，以Ⅱ型細胞因子(IL-4，IL-5，IL-9 和 IL-13等)的產(chǎn)生為主要特征。雖然遺傳因素等自身免疫力等因素在哮喘等過敏性疾病的病因?qū)W中發(fā)揮重要作用[2]，生活方式的改變是影響哮喘發(fā)病率的重要原因，尤其是抗生素的濫用被越來越多的研究者認為是導(dǎo)致哮喘發(fā)病率逐年上升的元兇之一[3]。

近年來發(fā)現(xiàn)菌群失調(diào)在哮喘的病理過程中起重要作用，Durack等[4]通過研究發(fā)現(xiàn)健康人和哮喘患者呼吸道菌群之間存在顯著差異，哮喘患者呼吸道有大量致病菌的產(chǎn)生和益生菌的減少。Marri等[5]對10名健康人和10名患有哮喘的人的研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者的痰液樣本中包含更豐富的變形菌門，而厚壁菌門豐度較低。中醫(yī)藥治療哮喘有良好的臨床療效，劉家齊[6]等發(fā)現(xiàn)芍藥苷對哮喘模型小鼠氣道炎癥趨化因子 CCL19 /CCL21 及其受體 CCR7 具有顯著的抑制作用從而起到拮抗哮喘的作用。任佳羽等[7]發(fā)現(xiàn)越婢加半夏湯降可低過敏性哮喘小鼠血清中IgE水平并提高小鼠肺組織抗氧化能力。中醫(yī)藥對哮喘的作用也可能與調(diào)節(jié)呼吸道菌群密切相關(guān)[8]，但目前缺乏合適的呼吸道菌群紊亂的動物哮喘模型，使得藥物機制研究變得困難。研究表明抗生素可以造成菌群紊亂，倪科等[9]對小鼠使用廣譜抗生素頭孢哌酮可引起其咽部優(yōu)勢菌群清除并對其咽部炎癥有所影響；徐星澈等[10]通過研究發(fā)現(xiàn)在大鼠生命早期使用頭孢霧化可使其上呼吸道菌群紊亂。本研究采用滴鼻和腹腔注射兩種方式給予抗生素并利用屋塵螨(HDM)研究哪種給藥方式會加重哮喘的發(fā)生，以建立合適的研究中藥與呼吸道菌群與哮喘之間關(guān)系的小鼠模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級6～8周齡雄性BALB/c小鼠，40只，體重18～22 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司南京分公司[SCXK(蘇)2016-0003]。小鼠接到后經(jīng)過紫外消毒，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心4樓GLP 中心屏障環(huán)境中[SYXK(蘇)2014-0001]。室溫：22℃～26℃，濕度：50%～60%，小鼠自由進食進水，實驗中所有動物操作均嚴(yán)格遵守《實驗動物管理與使用指南》，所有實驗經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審批，審批號：ACU170403，實驗整體以“3R原則”為基本原則，并給予動物人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

注射用頭孢哌酮舒巴坦鈉(Efoperazone sulbactam sodium for injection),國藥集團致君(深圳)制藥有限公司，貨號：H20050275,批號：K160101；屋塵螨(house dust mite, HDM, dermatophagoides pteronyssinus)，美國Greer Laboratory, 貨號：XPB70D3A25，批號：32278；嗜酸性粒細胞直接計數(shù)液(EOS計數(shù)液)，南京建成科技有限公司所，批號：20170605；過碘酸-雪夫染色(PAS)染液，南京建成科技有限公司,貨號：D004； Masson染液，南京建成科技有限公司，批號：20161031。BCA蛋白定量試劑盒，翼飛雪生物科技公司，貨號：YWB002； Mouse IgE ELISA Kit， Invitrogen by Thermo Fisher Scientific，批號：156530014； Mouse IL-5 Uncoated ELISA Kit， Invitrogen by Thermo Fisher Scientific，批號：179815002；Mouse IL-13 Uncoated ELISA Kit， Invitrogen by Thermo Fisher Scientific，批號：177134001。

精密電子天平，德國Sartorius公司；電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；冷凍離心機，德國Eppendorf公司，； Mantra，日本Olympus公司；包埋儀，德國Leica公司；光學(xué)顯微鏡，江南光電(南京)儀器股份有限公司；切片機，德國Leica公司；恒溫水浴槽，美國Crystal公司；BioStack Ready酶標(biāo)儀，美國Bio-Tek公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 抗生素的配置及換算

抗生素頭孢哌酮舒巴坦鈉臨床成人用量為1 ～2 g/d，按臨床最大劑量2 g/d，經(jīng)小鼠體表面積換算系數(shù)0.0026計算，得到小鼠臨床等效劑量為0.26 g/kg，腹腔注射0.1 mL/10 g，滴鼻每只20 μL。

1.3.2 分組

按體重分層法將40只雄性BALB/c小鼠隨機分為4組，即正常對照組(Control)、哮喘模型組(HDM)、滴鼻抗生素哮喘模型組(i.n. CFP+HDM)，腹腔注射抗生素哮喘模型組(i.p. CFP+HDM)，每組10只。

1.3.3 小鼠哮喘造模方法[11]

(一)哮喘模型造模方法：第0、7、14天，腹腔注射HDM 50 μg (0.1 mL， 0.5 mg/mL, PBS)， 第21～23天， 每天1次滴鼻HDM 25 μg (10 μL, 2.5 mg/mL, PBS)，最后一次滴鼻激發(fā)后24 h，取材。

(二)i.n. CFP+HDM及i.p. CFP+HDM造模方法：

(1)滴鼻抗生素哮喘模型組在哮喘造模的基礎(chǔ)上，自腹腔注射HDM后于第1、3、5天滴鼻給予小鼠頭孢哌酮，每只20 μL，第7天致敏后于第12天滴鼻給藥，第14天HDM致敏后于第15、17、 19天滴鼻給予小鼠頭孢哌酮，20 μL，每天上午給藥，小鼠自由進食進水。正常對照組用等量生理鹽水處理, 在HDM最后一次滴鼻激發(fā)后24 h，取材。

(2)腹腔注射抗生素哮喘模型組在哮喘模型的基礎(chǔ)上腹腔注射頭孢哌酮(0.1 mL/10 g)，自HDM攻擊后，第1、2、3天，連續(xù)3 d給藥，每天1次，自由飲食；第7天致敏后于第12天腹腔注射，第14天致敏后在第15、16、17天腹腔給予頭孢哌酮。正常對照組用等量生理鹽水處理，在HDM最后一次滴鼻激發(fā)后24 h，對小鼠進行取材。

1.3.4 大劑量抗生素加重小鼠哮喘造模成功指標(biāo)檢測[12]

(一)病理組織學(xué)檢查

實驗第 24天小鼠脫頸椎處死后，取約1/4肺組織，用4%甲醛進行固定，用石蠟進行包埋之后切片，再按說明書和實驗流程進行常規(guī)HE 染色、PAS染色及Masson染色，所有的切片均用多模式組織切片成像系統(tǒng)(Mantra)進行圖像采集。

HE染色：將包埋好的石蠟肺組織進行組織脫水、白片復(fù)水脫蠟、染色，最后用中性樹膠(顯微鏡用)封片。

Masson染色：切片同HE脫蠟復(fù)水處理，之后按試劑盒中的說明書步驟操作，進行染色。

PAS染色：新鮮的肺組織用Carnoy 固定液固定，按說明書進行PAS染色。

(二)小鼠血中Eosnophils (EOS)計數(shù)及血清中IgE檢測

4組小鼠在最后一次HDM滴鼻24 h后，用眼眥取血法，取小鼠靜脈血，將20 μL的血與試管中提前加好的380 μL的嗜酸性粒細胞計數(shù)液混勻，在顯微鏡下計數(shù)。剩余約800 μL的血液靜置1 h后，3500 r/min離心10 min，上清液按照ELISA試劑盒操作步驟測IgE。

(三)小鼠BALF(bronchoalveolar lavage fluid)及肺組織中Ⅱ型細胞因子檢測及BALF中總細胞數(shù)計數(shù)

HDM最后一次激發(fā)24 h后，即實驗第24天，小鼠脫頸椎處死，仰臥位體位固定，打開胸腔，結(jié)扎右肺葉，對左肺葉進行灌洗[13]。分離小鼠氣管周圍的組織等，使小鼠的氣管充分暴露，用醫(yī)療棉線固定灌洗針頭進行氣管插管。用300 μL的冰PBS進行灌洗，每次反復(fù)灌洗3次，合并灌洗液，1000 r/min，4℃，離心3 min，保存上清，待ELISA試劑盒檢測IL-13及IL-5水平。BALF沉淀細胞用500 μL的冰PBS進行重懸，吹打均勻后取20 μL，用細胞計數(shù)板計其中的總細胞數(shù)。將結(jié)扎部分肺組織剪下，取適量肺組織按10 mg：100 μL冰PBS的比例進行研磨組織，12 000 r/min，4℃離心10 min，棄去沉淀，留存上清，ELISA試劑盒檢測肺組織中的IL-5及IL-13水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 抗生素兩種給藥方式對HDM誘導(dǎo)哮喘模型小鼠小鼠肺部病理變化

2.1.1 小鼠肺組織炎癥浸潤

對四組小鼠肺組織進行HE染色，發(fā)現(xiàn)與空白組相比HDM造模后的小鼠表現(xiàn)出炎性浸潤與粘液過度分泌且伴隨著支氣管壁的增厚；i.n.CFP+HDM組較HDM組炎癥浸潤更加嚴(yán)重，有氣道重塑的趨勢，而i.p.CFP+HDM組與HDM組相比并沒有更加嚴(yán)重的炎癥浸潤的發(fā)生，但也較空白組有明顯的炎癥浸潤發(fā)生。見圖1。

2.1.2 小鼠細胞外基質(zhì)沉積的影響

對哮喘小鼠肺組織做Masson染色，考察抗生素兩種給藥方式(i.n.CFP，i.p.CFP)對哮喘小鼠氣道細胞外基質(zhì)沉積的影響。結(jié)果顯示，與空白組相比，HDM組已出現(xiàn)了明顯的呼吸道外基質(zhì)沉積，而i.n.CFP+HDM組會使小鼠氣道細胞外基質(zhì)沉積更加嚴(yán)重，但i.p.CFP+HDM組較HDM組未有顯著加重的趨勢。見圖2。

注：圖中實線箭頭所指為炎癥細胞，虛線箭頭所指的為增厚并發(fā)生重塑的支氣管上皮細胞。圖1 小鼠肺組織及氣道結(jié)構(gòu)的變化。HE染色觀察小鼠肺組織炎性浸潤Note. The solid line arrows indicate inflammatory cells and the dotted line arrows indicate thickened and remodeled bronchial epithelial cells.Figure 1 Histopathological changes and inflammatory infiltration in the mouse lung and respiratory tract tissues. HE staining.

注：圖中實線箭頭所指藍紫色為基質(zhì)沉積，虛線箭頭所指的為增厚的支氣管上皮細胞。圖2 小鼠肺組織的Masson染色實驗結(jié)果(n=10)Note. The blue-purple arrows on the solid line indicate extracellular matrix and the dotted arrows indicate thickened bronchial epithelial cells.Figure 2 Histological changes of the mouse lung tissues of control, HDM, i.n.CFP+HDM and i.p.CFP+HDM groups. Masson staining.

2.1.3 小鼠氣道黏液分泌情況

對4組小鼠肺組織作PAS染色，考察抗生素兩種給藥方式(i.n.CFP，i.p.CFP)對哮喘小鼠氣道粘液分泌的影響。結(jié)果顯示，HDM組較空白組已出現(xiàn)了粘液分泌增多，而與HDM組相比，i.n.CFP+HDM組小鼠氣道粘液分泌更加嚴(yán)重，但i.p.CFP+HDM組氣道粘液分泌較HDM組變化并不明顯。見圖3。

2.2 抗生素處理對HDM誘導(dǎo)哮喘模型小鼠體重、血清IgE、血中Eos、BALF總細胞數(shù)的影響

哮喘小鼠的體質(zhì)量與空白組小鼠相比在d24有明顯下降，而i.n.CFP+HDM組及i.p.CFP+HDM小鼠的體質(zhì)量自造模開始就呈下降趨勢(圖4B)；哮喘小鼠血清中IgE(圖4A)、BALF中總細胞數(shù)(圖4C)及血中的嗜酸性粒細胞數(shù)(圖4D)水平較空白組均顯著升高(P<0.05，P<0.01)，i.n.CFP+HDM組及i.p.CFP+HDM組小鼠血清中IgE(圖4 A)、BALF中總細胞數(shù)(圖4C)及血中的嗜酸性粒細胞數(shù)(圖4D)水平較空白組也顯著升高(P<0.05，P<0.01)，其中i.n.CFP+HDM組IgE水平較哮喘模型組有顯著升高(P<0.01)，見圖4。

2.3 抗生素兩種給藥方式對HDM誘導(dǎo)哮喘模型小鼠BALF及肺部Ⅱ型細胞因子的影響

i.n.CFP+HDM 組中小鼠BALF及肺組織勻漿中的IL-5、IL-13與空白組相比有顯著差異(P<0.05，P<0.01)，與HDM 哮喘模型組相比也有顯著升高(P<0.05，P<0.01)；而i.p.CFP+HDM組小鼠BALF中IL-5、IL-13水平雖然較空白組升高明顯(P<0.05)，但BALF及肺組織勻漿中的TH2細胞因子指標(biāo)較HDM組未見明顯差異。提示滴鼻抗生素組能明顯增加HDM哮喘小鼠的Ⅱ型細胞因子分泌。見圖5。

3 討論

哮喘是一種以TH2細胞因子表達水平增加為特征的慢性呼吸道炎癥性疾病。呼吸道是與外界空氣接觸最為頻繁的器官，隨著測序技術(shù)的發(fā)展，對于呼吸道菌群的認知從呼吸道無菌發(fā)展至呼吸道菌群與呼吸道疾病相關(guān)，Bassis 等[14]認為在健康人下呼吸道中菌群的定殖是來源于上呼吸道的；Khalkhali等[15]證實在兒童生命早期使用抗炎藥或抗生素治療等或在特殊環(huán)境下會增加哮喘的發(fā)生風(fēng)險，提示呼吸道菌群失調(diào)與哮喘密切相關(guān)[16-17]。雖然有研究表明呼吸道菌群與呼吸道疾病密切相關(guān)，一些藥物也通過調(diào)控菌群發(fā)揮作用，但是缺乏合適的動物模型，無法進行深入的機制研究，因此本研究的目的是探索建立合適的模型，為研究呼吸道微生物與呼吸道疾病之間的聯(lián)系及機制提供基礎(chǔ)。

注：圖中實線箭頭所指粉紅色為分泌的粘液。圖3 小鼠肺組織的PAS染色實驗結(jié)果(n=10)Note. The solid arrow in the figure indicates that pink is secreted mucus.Figure 3 Histological changes in the mouse lung tissues of control, HDM, i.n.CFP+HDM and i.p.CFP+HDM groups, and then assessed by image analysis. Periodic acid-Schiff (PAS) staining.

注：A為小鼠血清中IgE水平，B為各組小鼠體重變化，C為小鼠BALF中總細胞數(shù)，D為小鼠血中EOS數(shù)目，與i.n.CFP+HDM組相比，*P<0.05，**P<0.01.圖4 滴鼻給予抗生素及腹腔注射給予抗生素對哮喘模型小鼠A.血清中IgE水平的影響；B.小鼠體重變化趨勢；C.BALF中總細胞數(shù)；D.血中EOS數(shù)量Note. A, IgE in serum. B, Trends of changes in body weight. C, Total cell counts in BALF. D, Blood eosinophil counts. Compared with the i.n.CPF +HDM group, *P<0.05, **P<0.01.Figure 4 Effects of i.n CFP and i.p CFP on the four parameters in HDM-induced asthmatic mice. A, IgE in serum；B, Trends of changes in body weight. C, Total cell counts in BALF；D, Blood eosinophil counts.

注：與i.n.CFP+HDM組相比，*P<0.05，**P<0.01.圖5 抗生素兩種給藥方式對HDM誘導(dǎo)哮喘模型小鼠細胞因子分泌水平的影響(A)BALF中的IL-5；(B)BALF中的IL-13；(C)肺勻漿中的IL-5；(D)肺勻漿中的Note. Compared with the i.n.CFP+HDM group, *P<0.05, **P<0.01.Figure 5 Effects of i.n. CFP and i.p. CFP on the secretion of cytokines in the mice with asthma induced by HDM. A. IL-5 in BALF. B. IL-13 in BALF. C. IL-5 in lung tissue homogenate. D. IL-13 in lung tissue homogenate.

本研究以課題組前期已建立的哮喘模型為基礎(chǔ)，并以臨床研究為實驗參考[18]，探索建立了滴鼻給予抗生素頭孢哌酮舒巴坦鈉和腹腔注射給予抗生素頭孢哌酮舒巴坦鈉兩種給藥方式，觀察抗生素對哮喘模型的影響。由HDM誘導(dǎo)的哮喘有兩個最典型的特征，其一表現(xiàn)為外周血中的嗜酸性粒細胞的顯著升高、血清中IgE的異常[19]，其二表現(xiàn)為IL-4、IL-5、IL-13為代表的TH2型細胞因子的表達明顯上升[20]。本研究結(jié)果表明，在通過滴鼻給予抗生素后，可以發(fā)現(xiàn)血中EOS和血清IgE水平較空白組及HDM哮喘模型組均有所升高，肺組織及BALF中TH2細胞因子分泌也明顯增加，HE、Masson、PAS染色結(jié)果表明滴鼻給予抗生素哮喘小鼠相較于哮喘組有明顯的氣道炎癥浸潤，黏液過度分泌及膠原沉積，過敏性炎癥加重，而腹腔注射給予抗生素未見明顯加重哮喘模型的作用。提示由HDM誘導(dǎo)的哮喘模型小鼠已經(jīng)出現(xiàn)了的過敏性炎癥及氣道的病理組織學(xué)改變，滴鼻給予抗生素造成的小鼠哮喘更加嚴(yán)重，而綜合文獻提示抗生素加重哮喘的發(fā)生很有可能是通過使呼吸道菌群紊亂而造成的。一般來說，研究呼吸道菌群在呼吸系統(tǒng)疾病中的作用，利用GF小鼠是最佳的，但普通的實驗室大多并不具備飼養(yǎng)GF小鼠的無菌實驗室，并且GF小鼠并不符合人類機體的內(nèi)環(huán)境狀態(tài)，無法達到研究條件一致性，因此利用抗生素滴鼻給予SPF哮喘小鼠，并飼養(yǎng)在適宜的環(huán)境下，可以模擬健康人和哮喘患者的菌群生存狀態(tài)，這可以為之后研究藥物調(diào)節(jié)呼吸道菌群與哮喘提供一個合適的模型。