楊玲焰，王立鵬，榮 榮

(1.蘇州西山生物技術(shù)有限公司，蘇州 215123； 2.西交利物浦大學(xué)，蘇州 215123)

由于獼猴屬(Macaques)動(dòng)物與人類擁有共同祖先，他們的基因相似率大于93%，且在神經(jīng)學(xué)、生理學(xué)、代謝類疾病及對(duì)微生物的敏感性方面表現(xiàn)的都非常相似，所以獼猴屬動(dòng)物尤其是食蟹猴(Macacafascicularis, Cynomolgus monkeys)和恒河猴(Macacamulatta, Rhesus monkeys)作為非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，被廣泛用于生物醫(yī)藥研究中，近幾年，生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域的投入不斷加大，干細(xì)胞和移植研究也得到飛速發(fā)展，而對(duì)用于這方面研究的供體和受體動(dòng)物的血型要準(zhǔn)確的掌握，ABO血型是最重要的血型系統(tǒng)，所以當(dāng)實(shí)驗(yàn)猴被用于研究時(shí)就需要明確知道它的ABO血型，才能防止在移植中出現(xiàn)嚴(yán)重的排斥反應(yīng)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗及資源的浪費(fèi)。

目前應(yīng)用于人ABO血型鑒定的常規(guī)技術(shù)仍是基于抗原抗體反應(yīng)的血凝實(shí)驗(yàn)和微柱凝膠實(shí)驗(yàn)，但用于人血型檢測(cè)的商業(yè)試劑并不適用于實(shí)驗(yàn)猴的血型鑒定。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，ABO血型相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列都已確定，使血型研究進(jìn)入分子生物學(xué)時(shí)代。事實(shí)上血型差異主要是與基因突變有關(guān)，ABO血型基因上存在豐富的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)，通過分子生物學(xué)方法檢測(cè)ABO血型基因的SNP位點(diǎn)，可以確定A，B或AB表型。目前檢測(cè)SNP的方法很多，主要有Taqman PCR、普通PCR結(jié)合Sanger測(cè)序的方法、下一代測(cè)序 (next generation sequencing, NGS) 技術(shù)等。國(guó)際上已有多篇報(bào)道，用多重普通PCR方法或?qū)崟r(shí)定量PCR進(jìn)行實(shí)驗(yàn)猴的ABO血型分析[1-6]。競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR(competitive allele specific PCR，KASP)是在等位基因特異性PCR(allele specific PCR，AS-PCR)基礎(chǔ)上，在PCR試劑中加入通用的熒光探針，通過引物3’末端堿基與SNP位點(diǎn)上的堿基特異互補(bǔ)，然后通過直接識(shí)別熒光信號(hào)來對(duì)SNP分型以及檢測(cè)序列的插入和缺失，目前該技術(shù)在植物育種方面應(yīng)用較多，本文首次將KASP方法應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)猴ABO血型檢測(cè)，所選的2個(gè)SNP位點(diǎn)，是實(shí)驗(yàn)猴表達(dá)A和B轉(zhuǎn)移酶所必需的，第一個(gè)SNP位點(diǎn)是檢測(cè)A或B表型基因區(qū)域內(nèi)負(fù)責(zé)編碼第266位氨基酸的突變；第二個(gè)SNP位點(diǎn)是檢測(cè)第268位氨基酸的突變[5,7]。

目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道用KASP方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)猴ABO血型檢測(cè)。本文建立的KASP方法相較于普通PCR方法，節(jié)省了大量的時(shí)間；相較于Taqman探針法，節(jié)約了合成探針的費(fèi)用；本文同時(shí)還建立了普通PCR結(jié)合Sanger測(cè)序法用于血型檢測(cè)，適合沒有實(shí)時(shí)定量PCR儀的實(shí)驗(yàn)室開展ABO血型分析。

1 材料和方法

1.1 樣本

1.1.1 已知樣本

15份已確定ABO血型的食蟹猴核酸樣本由美國(guó)VRL實(shí)驗(yàn)室提供，干冰運(yùn)輸至本公司，-20℃存放。

1.1.2 重復(fù)性驗(yàn)證樣本

5份食蟹猴外周血樣本(EDTA.K2抗凝)，來自于昆明某實(shí)驗(yàn)猴養(yǎng)殖單位；1份恒河猴外周血，來自四川某實(shí)驗(yàn)猴養(yǎng)殖單位，共計(jì)6份樣本冷藏快遞運(yùn)輸至本公司，4℃存放。

1.1.3 臨床樣本

實(shí)驗(yàn)猴外周血樣本(EDTA.K2抗凝)，分別來自于廣州、廣西、四川、海南4個(gè)實(shí)驗(yàn)猴飼養(yǎng)場(chǎng)，共計(jì)51份樣本，其中食蟹猴全血38份，恒河猴全血13份，樣本冷藏快遞運(yùn)輸至本公司，4℃存放。

表1 ABO血型鑒定引物

1.2 主要試劑與儀器

血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，DP318)，KASP試劑(LGC， KBS-1016-001)，rTaq DNA聚合酶(5 U/μL) (TaKaRa, R001WZ)，dNTP Mix (2.5 mmol/L) (Takara, 4030)，瓊脂糖(天根生化，RT101)，GelRed(博美達(dá)，41003-0.5 mL)，特異引物用Primer 3軟件設(shè)計(jì)，由蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成。PCR產(chǎn)物測(cè)序由蘇州泓迅生物科技股份有限公司完成。熒光定量PCR儀(Bio-Rad，CFX96)，普通PCR儀(杭州博日科技有限公司，TC-96/G/H(b)A)，紫外分光光度計(jì)(GE, Nanovue plu)，紫外凝膠成像系統(tǒng)(上海勤翔，Genosens1560)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取

(一)重復(fù)性驗(yàn)證樣本

每個(gè)樣本取500 μL抗凝全血，做5個(gè)重復(fù)，參照血液基因組DNA提取試劑盒說明書提取核酸，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定核酸濃度，稀釋樣本使其核酸濃度調(diào)整為10 ng/μL左右。

(二)臨床樣本

每個(gè)樣本取500 μL抗凝全血，參照血液基因組DNA提取試劑盒說明書提取核酸，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定核酸濃度，稀釋樣本使其核酸濃度調(diào)整為10 ng/μL左右。

1.3.2 SNP位點(diǎn)的選取及引物設(shè)計(jì)

針對(duì)Premasuthan等[5]發(fā)布的位于15號(hào)染色體上7號(hào)外顯子的編碼區(qū)功能性突變位點(diǎn)的序列，用Primer 3在線引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)3組引物組，引物序列見表1。A組和B組引物組，為KASP方法所用的引物，可特異性識(shí)別這2個(gè)SNP位點(diǎn)上的堿基。C組引物是在這2個(gè)SNP位點(diǎn)的外圍設(shè)計(jì)的1對(duì)引物，用于Sanger測(cè)序驗(yàn)證。

1.3.3 KASP法

A組和B組引物組分別在2個(gè)體系中擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2×PCR試劑預(yù)混液5 μL；A組或B組引物混合液(F/H/R引物濃度為12/12/15 μmol/L)0.14 μL。每個(gè)體系均設(shè)立A型，B型，AB型陽性對(duì)照，以及不加核酸的空白對(duì)照。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性15 min，94℃ 20 s，退火溫度61℃開始每個(gè)循環(huán)降0.6℃，1 min，10個(gè)循環(huán)；94℃ 20 s，退火溫度55℃ 1 min，26個(gè)循環(huán)；94℃ 20 s，退火溫度57℃ 1 min，12個(gè)循環(huán)； 30℃ 30 s，讀取FAM和HEX熒光信號(hào)，采用Bio-Rad CFX Manager 3.1軟件分析結(jié)果。

1.3.4 普通PCR及測(cè)序

反應(yīng)體系：10× PCR buffer (Mg2+) 2.5 μL，dNTP Mix (2.5 mmol/L) 2.0 μL，C組引物等量混合液F/R (10 μmol/L) 1 μL，水14.3 μL，DNA模板5 μL，rTaq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.2 μL。每個(gè)體系均設(shè)立陽性對(duì)照，以及不加核酸的空白對(duì)照。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃ 45 s，退火溫度58℃ 30 s， 72℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)，72℃ 延伸5 min。電泳確認(rèn)：取5 μL PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳后，成像系統(tǒng)拍照。測(cè)序及序列分析：將PCR產(chǎn)物測(cè)序后用DNASTAR 7.1軟件分析序列中對(duì)應(yīng)SNP位點(diǎn)的堿基序列。

2 結(jié)果

2.1 已知樣本的方法確認(rèn)

2.1.1 KASP法結(jié)果

用KASP分型方法共檢測(cè)15份已知血型樣本，通過qPCR儀對(duì)產(chǎn)物中熒光信號(hào)的識(shí)別，可以很好地區(qū)分ABO血型。圖1 是A引物組的KASP分型結(jié)果，藍(lán)色正方形聚集點(diǎn)為HEX熒光信號(hào)，識(shí)別的是A型第266位氨基酸對(duì)應(yīng)的SNP突變位點(diǎn)的T堿基；橙色圓形聚集點(diǎn)為FAM熒光信號(hào)，識(shí)別的是SNP突變位點(diǎn)的A堿基；綠色三角形聚集點(diǎn)為同時(shí)有FAM和HEX熒光信號(hào)，同時(shí)識(shí)別到A和T堿基，這些樣本在該位點(diǎn)是雜合型的；黑色正方形點(diǎn)是空白對(duì)照，無熒光信號(hào)未識(shí)別到T或A堿基。15份已知樣本中KASP分型得到A型、B型和AB型各5份，與美國(guó)VRL公司用Taqman PCR方法分型結(jié)果完全一致。

圖1 KASP法鑒定ABO血型分型聚類圖Figure 1 ABO genotyping results by KASP

2.1.2 普通PCR結(jié)合Sanger測(cè)序方法驗(yàn)證結(jié)果

對(duì)這15個(gè)已知樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物測(cè)序后片段分析，最終得到A型、B型、AB型各5份，與KASP分型結(jié)果及美國(guó)VRL公司用Taqman PCR方法的分型結(jié)果完全一致，在2個(gè)SNP位點(diǎn)上的堿基與KASP分型結(jié)果一致。其中A型、B型、AB型3份樣本的測(cè)序結(jié)果見圖2，紅框中為對(duì)應(yīng)的2個(gè)位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果，圖最上面的數(shù)值為測(cè)序后核酸序列中各堿基的排序號(hào)。

2.2 KASP方法的重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果

KASP方法檢測(cè)了2份A型血，3份AB型血，1份B型血，每個(gè)樣從核酸提取到KASP檢測(cè)做了5次重復(fù)，每個(gè)血樣5次重復(fù)提取后的分型結(jié)果完全一致，針對(duì)2個(gè)SNP位點(diǎn)的KASP體系，血型結(jié)果也是完全符合(見圖3)。

2.3 臨床樣本檢測(cè)

2.3.1 KASP法結(jié)果

共檢測(cè)實(shí)驗(yàn)猴全血樣本51份，包括食蟹猴樣本38份，恒河猴樣本13份，表2為來自不同猴場(chǎng)血樣的血型結(jié)果，其中A型血9份(17.6%)，B型血19份(37.3%)，AB型血23份(45.1%)，4個(gè)實(shí)驗(yàn)猴養(yǎng)殖場(chǎng)均存在A型、B型、AB型動(dòng)物，但未檢出O型血?jiǎng)游铩?/p>

2.3.2 普通PCR結(jié)合Sanger測(cè)序法結(jié)果

選擇KASP方法鑒定出的A型、B型、AB型臨床樣本各5份，用普通PCR擴(kuò)增并測(cè)序后分析，所得的2個(gè)SNP位點(diǎn)上的堿基與KASP分型結(jié)果完全一致。

圖2 A型、B型、AB型樣本普通PCR序列比對(duì)圖Figure 2 Type A, B and AB sequence alignment from the PCR products

來源OriginA型Type AB型Type BAB型Type AB四川(恒河猴)Sichuan (Rhesus monkeys)364海南(食蟹猴)Hainan (Cynomolgus monkeys)139廣西(食蟹猴)Guangxi (Cynomolgus monkeys)212廣州(食蟹猴)Guangzhou (Cynomolgus monkeys)398食蟹猴Cynomolgus monkeys61319實(shí)驗(yàn)猴L(fēng)aboratory monkeys91923

圖3 KASP法鑒定ABO血型重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果分型聚類圖Figure 3 Repeatability verification of the ABO genotyping results by KASP

3 討論

靈長(zhǎng)類動(dòng)物的ABO血型存在跨物種多態(tài)性[8]。ABO血型系統(tǒng)為三復(fù)等位基因，有IA、IB和i三個(gè)基因，IA負(fù)責(zé)編碼N-乙酰氨基半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶，IB編碼D-型半乳糖糖基轉(zhuǎn)移酶，對(duì)抗原前體H進(jìn)行不同的修飾后，進(jìn)而得到了A抗原或B抗原，而i基因則不能編碼任何糖基轉(zhuǎn)移酶，故抗原前體H保持不變[9]。ABO血型的決定基因位于15號(hào)染色體上的9q34.1-9q34.2，包含7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，而第6和7外顯子上占了其多數(shù)的編碼序列，這些序列負(fù)責(zé)編碼ABO糖基轉(zhuǎn)移酶的催化結(jié)構(gòu)域，其中外顯子7共編碼344個(gè)氨基酸，占總ABO蛋白的催化域65%，血型差異主要是與基因突變有關(guān)，A抗原第266位氨基酸為亮氨酸和第268位為甘氨酸，而B抗原第266位為甲硫氨酸和第268位為丙氨酸[10]。因此可通過第266和268位密碼子堿基的改變來區(qū)分A和B糖基轉(zhuǎn)移酶。

基于抗原抗體反應(yīng)的人ABO血型檢測(cè)常規(guī)方法一般都不適用于實(shí)驗(yàn)猴，主要原因有以下三點(diǎn)：一是實(shí)驗(yàn)猴紅細(xì)胞表面的類人ABO抗原分子與人類的抗原分子結(jié)構(gòu)不一定完全相同；二是實(shí)驗(yàn)猴的ABO抗原分子抗原性極其微弱，在實(shí)驗(yàn)猴的紅細(xì)胞表面ABH抗原未找到；三是人源性的ABO抗血清用于實(shí)驗(yàn)猴檢測(cè)，存在種屬抗體的干擾[11]。之前有研究者用反定型和唾液抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)猴血型，也有用流式方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)猴體內(nèi)血型抗體水平[12-14]，但是對(duì)樣本要求比較高，需要獲取動(dòng)物的新鮮血液或足夠量的唾液樣本，而且由于方法的局限性，得到結(jié)果的可靠性不高。市面上可獲得的用于人血型檢測(cè)的商業(yè)免疫試劑，用于實(shí)驗(yàn)猴血型檢測(cè)一般均得不到可靠結(jié)果，且血清學(xué)結(jié)果有時(shí)也比較難判定。也有學(xué)者研究制備出實(shí)驗(yàn)猴專用ABO抗血清和改良吸收放散技術(shù)，但該方法耗時(shí)長(zhǎng)，也會(huì)有不確定的結(jié)果出現(xiàn)[11,15]。

隨著分子生物學(xué)方法在人類ABO血型中的應(yīng)用，研究人員通過對(duì)實(shí)驗(yàn)猴基因序列進(jìn)行分析，通過識(shí)別SNP位點(diǎn)堿基差異，對(duì)實(shí)驗(yàn)猴進(jìn)行ABO血型分型。AS-PCR方法有快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用，如疾病SNP監(jiān)測(cè)，血型分析等。Muro等[2]用AS-PCR結(jié)合定量PCR方法成功進(jìn)行人ABO血型的檢測(cè)。本文所用的KASP方法是基于AS-PCR原理，在PCR試劑中增加了通用的熒光探針，可通過直接識(shí)別熒光信號(hào)實(shí)現(xiàn)SNP快速分型。

本研究建立了KASP血型鑒定方法并與美國(guó)VRL實(shí)驗(yàn)室用的Taqman PCR方法進(jìn)行了比較，15份已知樣本的分型結(jié)果完全一致。同時(shí)新建立的KASP方法也與新建的普通PCR方法進(jìn)行了比較，結(jié)果完全一致。本文用建立的KASP方法檢測(cè)了國(guó)內(nèi)4家猴場(chǎng)的血液樣本51份，檢測(cè)到A型血占18%；B型血占37%；AB型血占45%；Premasuthan等[4]用多重PCR篩查78頭恒河猴，其中B型血的動(dòng)物占了51%，其次為AB型占28%，A型21%，與本實(shí)驗(yàn)恒河猴中血型分布相似，B型血占比為46%；Premasuthan等[5]于2012年又發(fā)表一篇文章，通過實(shí)時(shí)定量PCR方法，增加了89頭食蟹猴的篩選，其A、B、AB型分布為20%，48%，32%，而本實(shí)驗(yàn)食蟹猴中AB型血占比最高為50%，其次為B型34%，A型16%。Kanthaswamy等[6]擴(kuò)大了樣本量用熒光定量PCR方法篩查了1256只恒河猴，1113只食蟹猴，恒河猴中B型血占比達(dá)90%，A型占2%，AB型占8%；食蟹猴中A、B、AB型分別占39%、33%、28%。

本文所建立的ABO基因分型技術(shù)，是首次將KASP方法應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)猴ABO血型檢測(cè)，是在分子基因水平上的一種快速，可靠，敏感、低成本的檢測(cè)方法。本文新建的普通PCR方法結(jié)合Sanger測(cè)序同樣可對(duì)實(shí)驗(yàn)猴進(jìn)行ABO血型分型，對(duì)于沒有定量PCR儀的實(shí)驗(yàn)室同樣適用。該方法對(duì)樣本類型及新鮮程度都要求不高，血液樣品也可用濾紙片承載運(yùn)輸，可用于實(shí)驗(yàn)猴的ABO血型分型，為器官移植特別是干細(xì)胞移植非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型研究提供有效的保證，目前本實(shí)驗(yàn)人員用該方法進(jìn)行臨床樣本檢測(cè)尚未檢出O型血，這與其他研究者的結(jié)果也相符[4-6]。當(dāng)然不同血型占比與樣本量和動(dòng)物的來源都密切相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后給出血型分布的結(jié)論。人類的15號(hào)染色體的第6外顯子上存在O型血表型相關(guān)的突變位點(diǎn)，有文獻(xiàn)報(bào)道在實(shí)驗(yàn)猴中找到同樣的位點(diǎn)[16]，但有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)實(shí)驗(yàn)猴的第6和第7外顯子基因序列測(cè)序分析，均未發(fā)現(xiàn)有突變與O型血表型有關(guān)[4,7,17]。當(dāng)然也有文獻(xiàn)報(bào)道通過血清學(xué)方法檢出有實(shí)驗(yàn)猴是O型血[18-19]，但是考慮到血清學(xué)方法的弊端，對(duì)此結(jié)果仍然存在爭(zhēng)議；也有學(xué)者提出假設(shè)在編碼區(qū)外有可以識(shí)別O型等位基因的存在[5]；近期Choi等[3]報(bào)道O型血的存在，作者通過針對(duì)第7外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)引物，用PCR方法篩查了66只恒河猴，有8%的動(dòng)物為O型血，相關(guān)人員正在對(duì)這些與O型血表型相關(guān)的位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證中。實(shí)驗(yàn)猴是否存在O型血表型目前還是比較爭(zhēng)議的，下一步計(jì)劃就是找到這個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)。