崔愛缺，宮昳頔，章秀林，何 洋，張 瑋，韓凌霞，陳繼蘭，李長龍，陳洪巖*，陳振文*

(1.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，北京 100069； 2.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，哈爾濱 150069； 3.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

在禽類實驗動物中，雞在生命科學研究和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中應用最為廣泛。目前，北京SPF雞胚的年產(chǎn)量約840萬枚，非免疫雞胚也超過24萬枚。實驗動物遺傳質(zhì)量控制是科學研究結(jié)果可靠性和準確性的重要保障，也是相關生物制品質(zhì)量的重要保證。從遺傳學方面來說，目前我國的實驗用雞有封閉群和主要組織相容性復合體(MHC)單倍型兩種遺傳特征[1-2]。封閉群是一個遠交群體，繁育過程中應保持基因異質(zhì)性和多態(tài)性，繁殖方法應避免近交系數(shù)隨繁殖代數(shù)增加而過快上升。單倍型實驗用雞主要關注的是個別或部分基因的同質(zhì)性，繁殖方法采用全同胞或半同胞的繁殖方式。遺傳特性和繁殖方式?jīng)Q定了不同群體的遺傳質(zhì)量要求[3]。

微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)又稱短串聯(lián)重復(short tandem repeats，STR)，其包括核心序列和側(cè)翼序列兩部分，核心序列是以1～6個堿基為單位的DNA重復序列，重復次數(shù)一般不超過60次[4-5]。微衛(wèi)星具有信息含量高、基因組分布廣泛、高度多態(tài)性、測定簡單快捷等特點，已經(jīng)成為應用范圍最廣的分子標記[6-7]。目前我國已經(jīng)建立封閉群BWEL雞的微衛(wèi)星DNA的遺傳檢測方法以及MHC雞的測序檢測方法[3,8]。我國雞的品種非常豐富，應用于科學研究和生物制品生產(chǎn)檢定的品種也很豐富[9]。本研究采用不同遺傳背景的多種實驗用雞，研究探索實驗用雞微衛(wèi)星DNA遺傳檢測方法，將為實驗用雞遺傳質(zhì)量控制以及其他雞品種的遺傳結(jié)果分析提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗采用3個封閉群實驗用雞和3個單倍型雞群體。封閉群BWEL-SPF雞，樣本40個，37周齡，其中6♂34♀，來自白來航雞血統(tǒng)[SCXK(黑)2017-005]，目前已封閉飼養(yǎng)20世代；封閉群BM雞樣本40個，14周齡，其中6♂34♀，來自白來航雞血統(tǒng)[SCXK(黑)2017-005]；封閉群北京油雞樣本46個；MHC單倍型雞選育自第13代BWEL雞群，根據(jù)MHC核心基因連續(xù)選育單倍體型，已采用半同胞兄妹交配方式繁殖至第8代，本次檢測抽取了G1單倍型雞樣本5個，53周齡，其中1♂4♀；G2單倍型雞樣本5個，93周齡，其中1♂4♀；G7單倍型雞樣本5個，82周齡，其中1♂4♀。北京油雞樣本來源于中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，其余群體的血液樣本來源于中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心暨國家禽類實驗動物資源庫。所有實驗做到實驗動物3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

PCR擴增儀(ALS1296型，美國Bio-Rad公司)。電泳儀(PCR-30型，美國Bio-Rad公司)。血液基因組DNA提取試劑盒(Cat.#DP318-03)購于天根生化科技(北京)有限公司，蛋白酶K購于北京索萊寶科技有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTP購于大連寶生物工程有限公司；微衛(wèi)星引物、熒光標記微衛(wèi)星引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。STR掃描由北京天一輝遠生物科技有限公司完成。

1.3 實驗方法

1.3.1 選取微衛(wèi)星位點

通過文獻檢索和遺傳信息分析，篩選染色體均勻分布均勻、擴增效果好、多態(tài)性好、等位基因明確位點[10-12]，用于下一步的實驗篩選。

1.3.2 雞血液樣本DNA的提取

使用血液基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Blood DNA Kit)進行北京油雞血液樣本DNA的提取，采用紫外分光光度計和0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的濃度和純度，所有DNA濃度均稀釋為 50 ng/μL放置-20℃保存。

1.3.3 PCR反應條件優(yōu)化和瓊脂糖凝膠電泳初篩

每個微衛(wèi)星位點引物合成后進行PCR擴增，PCR反應體系為20 μL，10× buffer 2 μL，上下游引物(100 pM)各 1 μL，4× DNTP (100 μmol/L) 1 μL，Taq DNA聚合酶1 U 1 μL，基因組DNA(50 ng/μL)1 μL，純水(ddH2O) 15 μL，擴增時進行溫度梯度擴增，擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s；適宜退火溫度30 s；72℃延伸30 s；35個循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸7 min；擴增產(chǎn)物4℃保存。取擴增產(chǎn)物5 μL與1 μL的6×loading buffer混合后置于2%的瓊脂糖凝膠電泳中，120 V，60 min，拍照成像。根據(jù)電泳圖，挑選出擴增效率高、特異性好的位點保留，并記錄條帶最清晰時對應的最適溫度。

1.3.4 熒光標記與STR掃描

用FAM、HEX、TAMAR3種熒光標記分別標記初步篩選位點的上游引物5’端。用標記好的熒光引物對3個封閉群雞和3個單倍型雞的基因組DNA進行PCR擴增，將擴增好的PCR產(chǎn)物送往北京天一輝遠生物科技有限公司進行STR掃描。

1.3.5 統(tǒng)計分析STR掃描結(jié)果

將最終的掃描結(jié)果導入Gene Marker V2.2.0軟件，對于出現(xiàn)的典型波形進行分析與歸類：樣本基因型若為純合，則只有一個主波; 樣本若為雜和基因型，則有兩個或以上主波。

1.4 統(tǒng)計學方法

利用Gene Marker V2.2.0 軟件讀出6個群體樣本在每個微衛(wèi)星位點的擴增片段大小，并將每個位點的等位基因按照擴增片段由小到大的順序分別標記為A、B、C、D等，將其基因型按照AA、AB等格式輸入popgene 3.2軟件進行分析，得到在每個微衛(wèi)星位點上的觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、香隆指數(shù)和有效雜合度等信息[13]。利用PIC計算程序軟件計算多個位點的多態(tài)信息含量，將從popgene 3.2軟件中得到的每個位點的等位基因數(shù)以及等位基因在群體中的頻率輸入記事本中，建立一個擴展名為dat的文本文件，將該文件導入PIC計算程序軟件中可得到位點PIC值。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星位點的PCR初步篩選

通過文獻檢索和基因信息分析，共計獲得72個微衛(wèi)星位點。在瓊脂糖凝膠電泳中出現(xiàn)特異性的條帶共計58個位點，其條帶范圍為50～350 bp。封閉群位點初篩最終選出多態(tài)性較好的37個微衛(wèi)星位點。在單倍型中選出單態(tài)性好的32個微衛(wèi)星位點。以LEI0094位點為例，結(jié)果如圖1所示，LEI0094位點在封閉群中呈現(xiàn)多態(tài)，在單倍型群體中為單態(tài)出現(xiàn)。

注：圖1-A：位點LEI0094在北京油雞樣本的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；圖1-B：位點LEI0094在G1樣本的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。圖1 實驗用雞微衛(wèi)星DNA位點LEI0094的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Note. Figure 1A， LEI0094 in closed group of Ⅲ. Figure 1B， LEI0094 in inbred line G1.Figure 1 Results of agarose gel electrophoresis of microsatellite DNA locus LEI0094 in the experimental chickens

2.2 STR分析

將瓊脂糖凝膠電泳初篩獲得位點進行STR 掃描，并且將最終的掃描結(jié)果導入Gene Marker軟件，讀出并記錄波峰處的擴增產(chǎn)物的長度。排除等位基因較少、波峰形狀異常的位點后，最后確定用于封閉群遺傳檢測位點28個，用于單倍型遺傳檢測的位點14個，其中共用位點13個。其中GGVITC位點為共用位點，其在封閉群中為多態(tài)，存在122 bp、140 bp和146 bp的片段；在單倍型三個群體中均呈現(xiàn)為單態(tài)，但是在三個群體間存在差異，在G1群體中為150 bp的片段，在G2群體中為142 bp的片段，在G7群體中為146 bp的片段，結(jié)果如圖2所示。位點ADL0292在G1、G2群體中為單一峰，分別呈現(xiàn)128 bp和124 bp的片段，在G7群體中存在明顯雙峰，呈現(xiàn)120 bp和126 bp的片段。所有微衛(wèi)星DNA位點信息見表1。

2.3 群體遺傳分析

2.3.1 群體位點分析

將從STR中得到實驗用雞的位點信息輸入popgene 3.2后分析得到實驗用雞樣品在封閉群和單倍型的29個位點上的觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、有效雜合度及香隆指數(shù)。在封閉群中，28個微衛(wèi)星位點均表現(xiàn)出高度多態(tài)性，平均觀測等位基因數(shù)為7.9643個，其中LEI0141位點和LEI0094位點最高為16個，GGVITIIG*位點和GGNCAMZO位點最低為2個；平均有效等位基因數(shù)為4.9459個，其中LEI0141位點最高為9.3284個，GGVITIIG*位點最低為1.8349個；平均香隆指數(shù)為1.667，其中LEI0141位點最高為2.4409，GGVITIIG*位點最低為0.6474，表明在封閉群中，篩選位點的遺傳多樣性較好，且各位點的遺傳多樣性差別較大；平均有效雜合度為0.563，MCW0347位點最高為0.833，ADL0201位點最低為0.2183，表明群體中雜合度差異大，多數(shù)位點存在兩個及兩個以上等位基因。具體信息見表2。

表1 用于實驗用雞遺傳檢測的29個微衛(wèi)星位點

(續(xù)表1)

位點Loci引物序列(5'-3') Primer sequence 退火溫度(℃)Temperature等位基因數(shù)Allele number 等位基因范圍Allele range 適用群體Applicable groupsADL0201GCTGAGGATTCAGATAAGACAATGGCYGACGTTTCACAGC58.55151～179封閉群MCW0402ACTGTGCCTAGGACTAGCTGCCTAAGTCTGGGCTCTTCTG56.07177～203封閉群單倍型STMSGGHU2-1ACTTAATATGTGTGAGGTGGCGTTCTCACAATTGCATTAGC53.93158～165封閉群單倍型

表2 封閉群實驗用雞樣品的觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、有效雜合度、PIC和香隆指數(shù)

注：圖2-A：位點GGVITC下封閉群動物中表現(xiàn)為多態(tài)，分別為122 bp和146 bp；圖2-B：位點GGVITC下單倍型G1動物中表現(xiàn)為150 bp單態(tài)；圖2-C：位點GGVITC下單倍型G2動物中表現(xiàn)為142 bp單態(tài)；圖2-D：位點GGVITC下單倍型G7動物中表現(xiàn)為146 bp單態(tài)。圖2 實驗用雞微衛(wèi)星DNA位點GGVITC的STR掃描結(jié)果Note. Figure 2A， The STR diagram corresponding to the sample of closed group under primer GGVITC shows heterozygote with two wave peaks of 122 bp and 146 bp, respectively. Figure 2B, The STR graph corresponding to the sample of haploid type under primer GGVITC shows homozygote with a wave peak of 150 bp. Figure 2C, The STR graph corresponding to the sample of haploid type under primer GGVITC shows homozygote with a wave peak of 142 bp. Figure 2D, The STR graph corresponding to the sample of haploid type under primer GGVITC shows homozygote with a wave peak of 146 bp.Figure 2 Results of GGVITC scan of the experimental chekens

在3個單倍型群體中，14個微衛(wèi)星位點均表現(xiàn)出一致的單態(tài)性，平均觀測等位基因數(shù)為2.0714個，STMSGGHU2-1A位點最高為3個，其余位點均為2個，主要由于單倍型3個群體中位點一致性良好，但3個群體間存在差異；平均有效等位基因數(shù)為1.6972個，STMSGGHU2-1A位點最高為2.1778個，MCW0402位點最低為1.3243個；平均香隆指數(shù)為0.5995，STMSGGHU2-1A位點最高為0.876，MCW0402位點最低為0.4101，表明位點遺傳多樣性差，各位點遺傳多樣性相近；平均有效雜合度為0.3794，STMSGGHU2-1A位點最高為0.4983，MCW04021位點最低為0.2317，表明雜合度差異較小，所選位點的遺傳信息較為單一。具體信息見表3。

2.3.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

在3個封閉群中，北京油雞平均觀測等位基因數(shù)、平均有效等位基因數(shù)、平均香隆指數(shù)和平均有效雜合度均最高，表明北京油雞群體多樣性最好。BM種群中平均觀測等位基因數(shù)、平均有效等位基因數(shù)、平均香隆指數(shù)均最低，平均有效雜合度與BWEL均為0.5566。表明BM種群多樣性最低(表4)。

在單倍型群體中，單倍型G2、G7平均觀測等位基因數(shù)最高為2個，單倍型G1最低為1.8571個，三個群體內(nèi)異質(zhì)性較好，但是群體間存在一定的差異，主要受其繁殖方式(全同胞或半同胞)的影響。單倍型G2平均有效等位基因數(shù)最高為1.7243個，單倍型G1最低為1.6154個。單倍型G7平均香隆指數(shù)最高為0.5881，單倍型G1最低為0.5108。單倍型G1、G2、G7平均有效雜合度均為0.3794。3個群體的遺傳雜合度很低且一致性好(表5)。

3 討論

3.1 研究方法與分型方法的選擇

從DNA水平研究生物遺傳多樣性有多種研究方法，微衛(wèi)星DNA、線粒體DNA(mtDNA)、限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)和特定基因多態(tài)性等方法。趙獻芝等[14]采用將微衛(wèi)星標記與熒光標記引物測序相結(jié)合的技術研究了重慶地方雞品種的遺傳多樣；武艷平等[15]利用mtDNA的D-loop 區(qū)來分析江西地雞品種的群體結(jié)構(gòu)、網(wǎng)絡關系及系統(tǒng)進化情況；周敏等[16]采用此方法對4個雞品種進行VIPR-1 基因遺傳多樣性分析；常國斌等[17]運用該方法檢測雞A-FABP基因的SNP及后代分離群體不同基因型的時空表達規(guī)律。微衛(wèi)星DNA具有多態(tài)性高、共顯性遺傳和高分辨率等特點，且微衛(wèi)星標記較之其他方法如PCR-SSCP，有著操作簡單、分析程序簡潔、研究所需DNA量較小等優(yōu)勢，故而本研究選擇采用微衛(wèi)星DNA分子標記技術。

在微衛(wèi)星多態(tài)性分析中，分型方法主要包括瓊脂糖凝膠電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE) -銀染法、熒光標記引物測序法[18]。瓊脂糖凝膠電泳操作簡便、快速, 但是分辨率不高；PAGE-銀染法分辨率高，操作繁瑣，受其他因素影響大，而且在進行大批量樣本和標記分型時工作量大；熒光標記引物測序法，可以克服肉眼分辨能力不客觀等缺點，得到更加清晰的圖譜和準確的分析結(jié)果，快捷準確，真正實現(xiàn)了高通量與自動化的結(jié)合，試驗周期短，結(jié)果理想。另外，對于MHC單倍型雞的判定還可以采用PCR結(jié)合直接測序法，這種方法針對MHC核心區(qū)域的2個片段進行擴增并測序?qū)Ρ萚3]，適用于部分序列高度一致的群體，但此種方法對實驗儀器設備要求較高。因此，分析對比各種分型方法的優(yōu)缺點并結(jié)合本實驗的實際情況，本實驗選擇熒光標記引物測序法。

表3 單倍型實驗用雞樣品的觀測等位基因數(shù)，有效等位基因數(shù)，有效雜合度和香隆指數(shù)

表4 雞封閉群群體的平均觀測等位基因數(shù)、平均有效等位基因數(shù)、平均香隆指數(shù)、平均有效雜合度的比較

表5 單倍型雞群體的平均觀測等位基因數(shù)、平均有效等位基因數(shù)、平均香隆指數(shù)、平均有效雜合度的比較

3.2 雜合度與多態(tài)信息含量

雜合度是度量群體遺傳變異的一個參數(shù)。張劍等[19]利用29對微衛(wèi)星標記對北京油雞保種群192個個體進行了遺傳多樣性檢測，發(fā)現(xiàn)29個微衛(wèi)星中有19個位點呈高度多態(tài)，且平均期望雜合度為0.59。本研究中，封閉雞群的平均期望雜合度為0.56，其中北京油雞的平均期望雜合度為0.5630，與張劍等人研究結(jié)果相似，這也進一步證明北京油雞具有豐富的遺傳多樣性和較高的選擇潛力，可能是由于北京油雞群體較大等原因?qū)е?。在本研究?個單倍群體中平均有效雜合度均為0.3794，表明單倍型實驗用雞群體一致較好。這由于長期的全同胞和半同胞繁殖的結(jié)果。

多態(tài)信息含量(PIC)是衡量基因變異程度高低的一個指標，多態(tài)信息含量越高，基因座所提供的遺傳信息就越多[20]。本研究中，封閉群28個微衛(wèi)星座位中有26個位點處于高度多態(tài)，2個位點為中度多態(tài)，無低度多態(tài)位點。28個微衛(wèi)星座位的平均PIC為0.7162，能夠為評價實驗用雞的遺傳多樣性提供充分的信息。在3個單倍型群體中，所采用的14個位點中13個位點均表現(xiàn)為單態(tài)，只有1個位點表現(xiàn)為多態(tài)，說明單倍型群體產(chǎn)期的近交繁育使得其遺傳背景高度一致化。但是13個呈現(xiàn)單態(tài)的位點在單倍型群體間也存在差異，表明不同單倍型群體間依然存在不同。

實驗用雞的遺傳質(zhì)量控制對生命科學研究和生物制品生產(chǎn)具有非常重要的意義。本研究中選擇3個封閉群實驗用雞群體和3個單倍型雞群體，通過PCR、瓊脂糖凝膠電泳法和STR方法篩選，初步建立封閉群和單倍型實驗用雞的微衛(wèi)星DNA的遺傳檢測方法，并在3個封閉群和3個單倍型實驗用雞的群體中進行了應用。本研究建立的微衛(wèi)星DNA檢測方法適用于實驗用雞的遺傳質(zhì)量檢測。