王藝寧，劉新夢，章秀林，何 洋，張 瑋，杜小燕，李長龍，陳振文

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069)

實驗動物遺傳質(zhì)量直接影響實驗結(jié)果的穩(wěn)定性和真實性[1]。遺傳質(zhì)量檢測是控制實驗動物質(zhì)量的有效手段之一，通過遺傳檢測，可對實驗動物是否發(fā)生遺傳突變和遺傳污染進行分析，以確保實驗動物符合該品種品系的遺傳質(zhì)量要求[2]。禽類具有繁殖快、飼養(yǎng)成本低、體外孵化容易、胚胎細胞易獲得等優(yōu)點，應(yīng)用十分廣泛，其中實驗用雞在疫苗研究和生產(chǎn)過程中發(fā)揮重要作用[3]。鴿(Columbaliviadomestica)作為另一種常用于科學(xué)研究的禽類實驗動物，擁有繁殖性能佳、飛行能力強等生物學(xué)特性，在病毒學(xué)研究等方面發(fā)揮重要作用[4-5]。但是國內(nèi)外關(guān)于實驗用鴿的質(zhì)量控制方法尚不完善，特別是在遺傳質(zhì)量控制方面，尚無檢測方法，極大地限制了鴿在研究中的應(yīng)用。

微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)方法在實驗動物遺傳檢測中應(yīng)用廣泛[6-10]。微衛(wèi)星DNA又稱簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat, SSR), 是指以1～6個核苷酸為單位多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列。微衛(wèi)星DNA在遺傳檢測方面具有以下優(yōu)點：①在染色體上數(shù)量廣泛且分布均勻，具有較好的代表性；②具有豐富的多態(tài)性，遺傳信息量大；③易檢測、結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好；④具有共顯性遺傳，可用于鑒別雜合子和純合子[11]。在本實驗中，通過篩選分布均勻、擴增穩(wěn)定、特異性好、多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星位點，初步建立了封閉群實驗用鴿遺傳檢測方法，并對國內(nèi)2個封閉群鴿群體進行了遺傳分析，為封閉群實驗用鴿種群遺傳質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

隨機選取封閉群鴿白羽王和銀王2個種群各40只，雌雄各半，日齡不限，所有動物來自北京市柳金龍肉鴿養(yǎng)殖場。動物均采用口腔屠宰法處死，后采集心臟組織，并置于-20℃冰箱凍存。所有實驗均做到實驗動物3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

PCR擴增儀(Bio-Rad公司，美國)。核酸電泳儀(PCR-30型，Bio-Rad公司，美國)。核酸凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)。超微量分光光度計(Nanodrop，美國)。蛋白酶K、Tris-飽和酚(北京索萊寶科技有限公司)。50 bp DNA marker、6× loading buffer(大連寶生物工程有限公司)。引物由北京天一輝遠生物科技公司合成，熒光標記微衛(wèi)星引物合成和STR掃描由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 實驗方法

1.3.1 微衛(wèi)星位點的選取

通過檢索文獻和利用SSR Hunter軟件分析鴿基因遺傳信息，獲得用于進一步篩選的鴿微衛(wèi)星位點。

1.3.2 樣本DNA提取

利用酚-氯仿抽提法提取心臟組織的DNA。稱量組織樣本0.1 g搗碎，置于10 mL離心管中，加2 mL裂解液， 20 μL蛋白酶K，混勻后37℃震蕩過夜，轉(zhuǎn)速200 r/min。次日使用酚/氯仿抽提組織基因組DNA。提取得到的DNA用TE緩沖液稀釋，使用超微量分光光度計檢測DNA濃度，確定OD260/280均處于1.8～2.0范圍內(nèi)，并將所有DNA濃度均稀釋為50 ng/μL，放置-20℃冰凍保存。

1.3.3 PCR體系和瓊脂糖凝膠電泳初篩微衛(wèi)星位點

PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中10 × Loading buffer 2 μL, 純水(ddH2O): 7 μL，上下游引物(100 pmol/μL)：各1 μL，基因組DNA：1 μL，鎂離子終濃度1.5 mmol /L。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性，5 min；94℃變性，30 s；適宜退火溫度，30 s；72℃延伸，30 s；35個循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸7 min；擴增產(chǎn)物 -20℃保存。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳130 V，90 min，成相拍照。

1.3.4 STR掃描

對備選位點PCR擴增結(jié)果進行STR掃描。對引物上游進行熒光標記，分別為FAM、HEX、TAMRA 3種。運用合成的熒光引物對2個封閉群鴿基因組進行擴增, PCR反應(yīng)條件遵循最終確定的優(yōu)化條件，反應(yīng)體系為20 μL。對擴增得到的樣本送至公司進行STR掃描。

1.3.5 STR掃描結(jié)果的判讀與統(tǒng)計分析

首先將表面溫度源加熱裝置升溫至溫度點穩(wěn)定后，使用表面溫度計分別在圖1中所示的五個測量位置，按照位置編號0-1-0-2-0-3-0-4-0的順序，每隔1min測量一個位置點的溫度，讀數(shù)后迅速將表面溫度計移至下一測量位置，共測一遍。然后將表面溫源升溫至下一個溫度點，重復(fù)上述操作過程。

將最終的掃描結(jié)果導(dǎo)入Gene Marker軟件，對出現(xiàn)的典型波形進行分析與歸類：樣本基因型若為純合，則只有一個主波；樣本若為雜和基因型，則有兩個或以上主波。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

整理由STR掃描得到的每個微衛(wèi)星標記的基因片段大小，按照從小到大的順序分別標記為a、b、c、d等。將從STR掃描得到的16個微衛(wèi)星標記的基因型按照a a、a b等格式輸入Popgene 3.2軟件進行分析，并進一步計算觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、香隆指數(shù)和有效雜合度等。將從Popgene 3.2軟件中得到的各等位基因數(shù)及其在群體中的頻率轉(zhuǎn)換為PIC計算程序軟件所需格式并導(dǎo)入，最終得到各位點PIC值。

2 結(jié)果

2.1 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

通過檢索文獻和利用SSR Hunter軟件分析鴿基因遺傳信息，獲得61個鴿微衛(wèi)星位點。進行溫度梯度PCR和瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)條帶的擴增特異性及擴增效率，明確61個位點的最適擴增條件。

2.2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果以及微衛(wèi)星位點的初篩

按照最適宜擴增條件對61個位點進行PCR擴增，并且將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，從61個位點中篩選出長度適宜、多態(tài)性良好且特異性高的20個位點進行后續(xù)實驗。以C26L10(1404758)位點為例，其瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。

注：圖1-A：白羽王群體1～23號DNA樣本在位點C26L10(1404758)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；圖1-B：白羽王群體24～40號DNA樣本以及銀王群體1～6號DNA樣本在位點C26L10(1404758)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；圖1-C：銀王群體7～29號DNA樣本在位點C26L10(1404758)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；圖1-D：銀王群體30～40號DNA樣本1～23號DNA樣本在位點C26L10(1404758)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。圖1 80只鴿DNA樣本在位點C26L10(1404758)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Note. Figure 1-A， 1-23 DNA sample of WHITE KING population at site C26L10(1404758). Figure 1-B， 24-40 DNA samples from WHITE KING population and 1-6 DNA samples from SILVER KING population at site C26L10(1404758). Figure 1-C， the 7-29 DNA sample of SILVER KING population at site C26L10(1404758). Figure 1-D: the locus C26L10(1404758) of SILVER KING population DNA sample no. 30-40 (1-23).Figure 1 Agarose gel electrophoresis results of 80 pigeon DNA samples at locus C26L10 (1404758)

2.3 STR掃描結(jié)果

將初篩后的20個位點進行STR掃描，并將最終得到的掃描結(jié)果導(dǎo)入Gene Marker軟件，讀出并記錄波峰處擴增產(chǎn)物的片段長度。排除等位基因較少、波峰形狀異常的位點后，最終篩選出16個多態(tài)性好、等位基因多且具有典型的Stutter峰的微衛(wèi)星位點。位點信息如表1所示。

對比瓊脂糖凝膠電泳得到的結(jié)果圖，可見STR掃描在區(qū)分基因型方面有更高的敏感度，其得到的基因位點數(shù)目更加準確。以C26L10 (1404758)位點為例，STR掃描結(jié)果見下圖2所示，16個微衛(wèi)星位點名稱、引物序列、最大等位基因數(shù)、等位基因范圍及擴增條件見表1。

2.4 封閉群實驗用鴿群體遺傳分析

2.4.1 實驗用鴿微衛(wèi)星DNA位點分析

篩選出的的微衛(wèi)星位點均在群體中呈現(xiàn)較好的多態(tài)性，16個位點共檢測到136個等位基因。其中位點C26L1(20390)具有最高的觀測等位基因數(shù)(16)，表明此位點具有最高的基因多樣性。位點C26L10(1404758)的平均有效等位基因數(shù)(9.1176)、香隆指數(shù)(2.2806)及有效雜合度(0.8602)均最高，表明此位點在群體內(nèi)個體間差異大、離散度高且群體具有較高的基因穩(wěn)定性。此外，位點PG5具有最低的觀測等位基因數(shù)，位點UU-Cli07具有最低的有效等位基因數(shù)、香隆指數(shù)及有效雜合度。16個位點在80個鴿DNA樣本的觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、香隆指數(shù)、有效雜合度、多態(tài)信息含量的具體信息見表2。

表1 16個微衛(wèi)星位點名稱、引物序列、最大等位基因數(shù)、等位基因范圍及擴增條件

Table 1 Names, primer sequences, maximum allelic number, allelic range and amplification conditions of 16 microsatellite loci

位點名稱Loci引物序列(5'-3')Primer sequence最大等位基因數(shù)The maximum number of alleles等位基因范圍Allele range退火溫度(℃) TemperatureMg離子濃度(mmol /L)MgCl2UU-Cli02TGGGCAAGGTACACTTTTAGGTCTTTATGCTCCCCCTTGAGAT5158～170611.5UU-Cli06TTTGAAAAACATGGATTGTGCAATTTGCAGAGGGTGAGTGG4140～145561.5PG5GTTCTTGGTGTTGCATGGATGCAGTTACGAAATGATTGCCAGAAG2262～266591.5C26L9(1265223)CAAAGCTGCTGACGTGAATCAAAGAGACGCTCCATGCAAAAG4467～472591.5UU-Cli14CAGAACGTTTTGTTCTGTTTGGTCTTGCTGCAGTCTTCATCC10265～292581.5C12L1(532572)GTTGTTTGGCTGAGTGGACGTCAACCAGGGGAATTGGCAG4126～136621.5C12L4(906353)GCTGCTGTCTTCTTCATTGGGTTAAAACCTCCCGTCTCCCTG11210～250601.5CliμD11CCAATCCCAAAGAGGATTATACTGTCCTATGGCTGAAGTG778～98581.5C26L10(1404758)GCTGTCAGGTATCAGCCACAATCAGACCCACGAAAGCTGTAA11211～226591.5C26L4(568923)CAACCCCATGTGGGTGAGACCACCACCACGTGGGACATC13357～432631.5PG4CCCATCTCCTGCCTGATGCCACAGCAGGATGCTGCCTGC10136～170641.5UU-Cli12CGCCAGACTGTATTGTGAGCAGCATGGCTGTTCTTTGAGG18231～265611.5CliμT47ATGTGTGTTTGTGCATGAAGATGAAAGCCTGTTAGTGGAA7183～214561.5CliμD32GAGCCATTTCAGTGAGTGACAGTTTGCAGGAGCGTGTAGAGAAGT9136～158601.5UU-Cli07GCTGCCTGTTACTACCTGAGCCTGGCCATGAAATGAACTCC5277～310611.5C26L1(20390)AGGAGCCTACACTGGGTTTTCTGTAGCTCTGCAATCAGCCT16250～268601.5

表2 80個鴿DNA樣本在16個位點的觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、香隆指數(shù)、有效雜合度、多態(tài)信息含量

注：圖2-A：白羽王群體7號DNA樣本在位點C26L10(1404758)所對應(yīng)的STR圖，雜合子，有兩個波峰，分別為213 bp和219 bp；圖2-B：白羽王群體36號DNA樣本在位點C26L10(1404758)所對應(yīng)的STR圖，純合子，有一個波峰，為219 bp。圖2 白羽王群體部分DNA樣本在位點C26L10 (1404758)的STR圖Note. Figure 2A, STR diagram corresponding to the C26L10(1404758) of the DNA sample of WHITE KING population no.7. Heterozygote has two wave peaks, which are 213 bp and 219 bp, respectively. Figure 2B, The STR diagram corresponding to the locus C26L10(1404758) of the DNA sample no.36 of WHITE KING population. Homozygote, with a wave peak, is 219 bp.Figure 2 STR figure of part of the DNA sample of WHITE KING population at C26L10(1404758)

表3 銀王與白羽王群體的平均觀測等位基因數(shù)、平均有效等位基因數(shù)、平均香隆指數(shù)、平均有效雜合度的比較

鴿子銀王和白羽王群體是北京地區(qū)用于科學(xué)研究的兩種主要實驗用鴿群體。群體分析結(jié)果顯示，銀王和白羽王群體的平均有效雜合度均為0.6488；銀王和白羽王群體的平均香隆指數(shù)分別為1.3072和1.4353。銀王與白羽王群體的平均觀測等位基因數(shù)、平均有效等位基因數(shù)、平均香隆指數(shù)、平均有效雜合度的比較見表3。

3 討論

3.1 研究目的

目前，隨著我國生命科學(xué)領(lǐng)域科研水平的提高及研究內(nèi)容的深入，人們越來越重視實驗動物的遺傳質(zhì)量控制。與此同時，各學(xué)科對于實驗動物品種和品系的需求也進一步加大。鑒于我國實驗動物品種品系數(shù)量嚴重少于發(fā)達國家，這也成為桎梏我國生命科學(xué)和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要瓶頸問題，豐富實驗動物品種和品系的任務(wù)刻不容緩。

鴿是生活中常見的一種動物，在我國家禽養(yǎng)殖行業(yè)中有著廣泛的市場和發(fā)展前景。在生物科學(xué)研究中，實驗用鴿主要用于與病毒[12]、細菌[13]之間的相互作用以及目標導(dǎo)向的神經(jīng)通路[14]相關(guān)方面的科學(xué)研究。由于鴿有著繁殖速度快、孵化周期短、飼養(yǎng)成本低等優(yōu)點，其未來在疫苗研發(fā)、藥物臨床實驗、疾病研究等領(lǐng)域有著巨大的潛在價值，對實驗用鴿進行標準化研究對鴿在生命科學(xué)研究及生物制品生產(chǎn)和鑒定等領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。

3.2 研究方法的選擇

常用實驗動物遺傳質(zhì)量檢測方法有毛色基因測試法、生化標記基因檢測法、免疫標記基因檢測法、DNA 分子標記法等。前幾種檢測方法分別具有檢測位點少，所需時間長、操作復(fù)雜、費用昂貴等缺點[1]。而DNA 分子標記可直接在 DNA 分子水平上檢測生物間的差異, 能直接反映DNA 水平上的遺傳變異，是如今被廣泛應(yīng)用的基因標記方法。其中微衛(wèi)星DNA(STR)標記具有分布廣泛、片段小、信息含量高、PCR放大后易分析、具有高度多態(tài)性等多種優(yōu)點[15]，且已具有成熟技術(shù)。本研究中采用微衛(wèi)星DNA標記法初步建立封閉群實驗用鴿的遺傳質(zhì)量檢測該方法。結(jié)果表明，該方法適于實驗用鴿的遺傳結(jié)構(gòu)分析，可用于遺傳質(zhì)量檢測。

3.3 關(guān)于群體的遺傳多樣性

群體的平均有效雜合度是群體遺傳多樣性的重要指標，可反映被檢測基因的豐富度[16]。一般認為，當(dāng)群體的平均有效雜合度低于0.5時，表明該群體內(nèi)個體差異較小，遺傳雜合度較低[17]，不符合封閉群動物遺傳特征。當(dāng)群體的平均有效雜合度處于0.5～0.7之間時，表明該群體沒有受到高強度的選擇，遺傳多樣性較為豐富[18]。當(dāng)群體的平均有效雜合度高于0.7時，其遺傳多樣性偏高，若需要推廣使用該群體，必須對其進行系統(tǒng)選育[19]，也不符合封閉動物群體遺傳特征。本實驗中銀王群體和白羽王群體的平均有效雜合度均為0.6488，達到封閉群實驗動物群體合格的量化標準，證實為兩個理想的封閉群體。平均香隆指數(shù)是衡量微衛(wèi)星多態(tài)性的重要指標，可表明所選微衛(wèi)星位點整體多態(tài)性良好與否，本實驗中銀王和白羽王群體的平均香隆指數(shù)分別為6.125和7.375，表明所篩選位點的平均多態(tài)性良好。

在衡量基因變異程度高低時，多采用多態(tài)信息含量(PIC)作為變異指標，一般認為，當(dāng)PIC 在 0.25 與 0.5 之間時為中度多態(tài)，當(dāng) PIC<0.25 時顯示低度多態(tài)性，當(dāng) PIC 大于0.5時顯示高度多態(tài)性[20]。在本研究中，除位點PG5與位點UU-Cli07處于中度多態(tài)之外，其余14個微衛(wèi)星位點均處于高度多態(tài)，表明篩選出的位點中雜合子比例較大，所提供的遺傳信息豐富[21]，可作為有效遺傳標記。

本實驗將PCR技術(shù)、瓊脂糖凝膠電泳以及STR掃描技術(shù)結(jié)合在一起進行微衛(wèi)星位點的優(yōu)化。首先通過檢索文獻得到32個已報道的鴿微衛(wèi)星位點[22-24]，此外還利用SSR Hunter軟件結(jié)合PubMed搜索得到的鴿子DNA信息，篩選出29個微衛(wèi)星位點。通過溫度梯度PCR以及瓊脂糖凝膠電泳的方法選出最適宜的退火溫度，成功優(yōu)化了PCR反應(yīng)體系，篩選出20個微衛(wèi)星位點。鑒于瓊脂糖凝膠帶電泳只能分辨10 bp以上的條帶，本實驗還利用STR掃描技術(shù)進一步確認瓊脂糖凝膠電泳的檢測結(jié)果，最終篩選出等位基因豐富、擴增效果明顯，多態(tài)性良好的16個位點。

在篩選出微衛(wèi)星位點后，本實驗還對2個封閉群實驗用鴿群體進行了遺傳質(zhì)量分析，結(jié)果顯示16個位點均具有豐富的遺傳多樣性和較高的應(yīng)用潛力。通過以上實驗，本研究初步建立了實驗用鴿微衛(wèi)星DNA遺傳檢測方法，為實驗用鴿遺傳質(zhì)量的標準化奠定了基礎(chǔ)。