黃 鑫，古文鵬，黎曉慧，李 娜，賈 杰，李明學(xué)，代解杰*

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)，昆明 650500； 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)樹鼩標(biāo)準(zhǔn)化與應(yīng)用研究省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，昆明 650118)

高級(jí)別肉瘤(high-grade sarcoma) 多發(fā)生于骨和軟骨組織的少見(jiàn)惡性間葉性腫瘤，其主要由成纖維細(xì)胞和多形性細(xì)胞組成。近年來(lái)許多研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及治療預(yù)后有密切的相關(guān)，已經(jīng)發(fā)展成為腫瘤領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題[1-2]。目前已有研究者報(bào)道，腸道微生物在結(jié)腸癌和胃癌等腸道癌癥的病程發(fā)展中起到了重要的作用，另外還參與乳腺癌、宮頸癌、肝癌等非腸道癌癥的發(fā)病[3-4]。有證據(jù)證明，樹鼩在進(jìn)化地位上更接近于人類，并且樹鼩的新陳代謝遠(yuǎn)比小鼠、家兔更接近于人，大體解剖也接近于人，因此在生物醫(yī)學(xué)以及醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域有著更重要的應(yīng)用價(jià)值[5-6]。在本研究中，共選取了9例樣本，其中3例為患有高級(jí)別肉瘤的樹鼩和6例健康對(duì)照組的樹鼩糞便樣本作為研究對(duì)象。

本研究采用高通量測(cè)序平臺(tái)，構(gòu)建小片段文庫(kù)進(jìn)行單端測(cè)序，并進(jìn)行物種注釋及豐度分析，旨在研究患有高級(jí)別肉瘤的樹鼩腸道菌群結(jié)構(gòu)，并與健康樹鼩腸道微生物結(jié)構(gòu)與多樣性進(jìn)行比對(duì)，初步探討腸道微生物與高級(jí)別肉瘤之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及樣本

本項(xiàng)研究共包括9只雌性樹鼩。其中包括3例HE病理染色診斷為患有高級(jí)別肉瘤的樹鼩(CA組)采集直腸新鮮糞便樣本1～2 g，隨機(jī)選擇同期6例健康樹鼩新鮮糞便樣本為健康對(duì)照(NO組)。平均年齡(4±1)歲，體重180～200 g。9只樹鼩從未發(fā)生過(guò)消化系統(tǒng)疾病，也未使用過(guò)抗生素。普通級(jí)中緬樹鼩滇西亞種 (tree shrew,Tupaiabelangerichinensis) 由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心提供[SCXK(滇)K2018-0002]，并飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心普通環(huán)境中[SYXK(滇)K2018-0002]，于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。并根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予實(shí)驗(yàn)樹鼩人道主義關(guān)懷。

1.2 研究方法

CA組和NO組采集的新鮮糞便樣品為1～2 g，于-80℃冰箱凍存。采用CTAB法提取樣本基因組DNA。模板為稀釋后的基因組DNA，PCR使用帶Barcode 的特異引物和高效保真酶，來(lái)鑒定細(xì)菌多樣性[7]。使用T Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫(kù)試劑盒構(gòu)建文庫(kù)，截去Barcode和引物序列初步質(zhì)控得到原始數(shù)據(jù)(Raw reads)、 Reads序列通過(guò)與物種注釋數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)(Clean Reads)；利用Uparse 軟件對(duì)所有樣品的全部 Clean Reads 進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為OTUs，對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur方法與SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋分析[8]。對(duì)OTUs進(jìn)行Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本文采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，對(duì)分組樣本的群落結(jié)構(gòu)以及物種組成進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樣本病理檢查

將動(dòng)物麻醉后解剖，取黃豆粒大小的腫瘤組織立即放入多聚甲醛中固定，并進(jìn)行HE染色病理檢測(cè)。腫瘤組織由增生的梭形及多形性細(xì)胞混合而成，且核異型性明顯，核分裂像多見(jiàn)(見(jiàn)圖1所示)。經(jīng)病理檢查該三例病例判斷為高級(jí)肉瘤。

圖1 樹鼩高級(jí)別肉瘤的病理學(xué)特征(HE染色,×400)Figure 1 Pathological features of the high-grade sarcoma in tree shrews (HE staining)

表1 患有高級(jí)別肉瘤的樹鼩和健康樹鼩對(duì)照多樣性指數(shù)比較

注：與高級(jí)別肉瘤組相比，P>0.05。

Note. compared with the high-grade sarcoma group，P> 0.05.

2.2 高通量測(cè)序序列分析

通過(guò)對(duì)CA組和NO組樹鼩糞便DNA進(jìn)行高通量測(cè)序后獲得1 122 429條優(yōu)化序列，樣本的序列有效長(zhǎng)度平均為252.14 bp，總樣本的平均序列為80 173.5條，以97%的一致性將OTUs聚類，并對(duì)OTUs的代表序列進(jìn)行物種注釋。CA組和NO組樹鼩腸道微生物做組間群落結(jié)構(gòu)Anosim 組間差異分析差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖2)(P>0.05)。

注：縱坐標(biāo)為樣本間距離的秩。橫坐標(biāo)：Between為兩組之間的結(jié)果，其他兩個(gè)為各自組內(nèi)的結(jié)果。圖2 Anosim 組間差異分析Note. Ordinate, the rank of the distance between samples. Abscissa, Between is the result between two groups, and the other two are the results within their groups, respectively.Figure 2 Anosim difference analysis between the tree shrew groups

2.3 腸道菌群的多樣性分析

兩組樹鼩腸道菌群的多樣性指數(shù)如表1所示，測(cè)序所得到的結(jié)果能夠反映出所有樹鼩糞便樣本菌群結(jié)構(gòu)，對(duì)所有樣品的Shannon指數(shù)值、Chao1指數(shù)值、ACE指數(shù)值和Simpsaon指數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，將高級(jí)別肉瘤組和健康對(duì)照組比較， Shannon指數(shù)值、Chao1指數(shù)值、ACE指數(shù)值以及Simpson指數(shù)值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明，CA組和NO組的樹鼩腸道菌群Alpha多樣性沒(méi)有明顯差異。

2.4 腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 高級(jí)別肉瘤組與健康對(duì)照組在門水平上比較

研究共包含9個(gè)樣本，樹鼩腸道內(nèi)菌群共包含18個(gè)門包括厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes)、螺旋菌門(Spirochaetes)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、產(chǎn)氧光細(xì)菌門(Oxyphotobacteria)等；以及189個(gè)屬。由圖三可知，在門分類水平上將這兩組進(jìn)行兩兩對(duì)比發(fā)現(xiàn)，大部分樣本屬于4個(gè)門類：厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)，占腸道內(nèi)全部細(xì)菌比例的90%以上。其中，厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)在CA組和NO組兩組中的豐度均最高，厚壁菌門(Firmicutes)分別占77.79%和47.65%，變形菌門(Proteobacteria)在兩組中分別占18.32%和27.33%，豐度較高的梭桿菌門(Fusobacteria)，在兩組中分別占0.115%和14.49%；擬桿菌門(Bacteroideres)在兩組中分別占0.75%和8.31%。經(jīng)分析得出，CA組與NO組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的菌門為螺旋體門(Spirochaetes)，其在CA組中豐度為0.03%，在健康對(duì)照組中豐度為0.12%，NO組相對(duì)豐度豐度明顯高于CA組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3和表2所示)。

2.4.2 高級(jí)別肉瘤組和健康對(duì)照組在屬水平上比較

將CA組和NO組在屬水平上進(jìn)行比較，經(jīng)分析得到192種不同的細(xì)菌，高級(jí)別肉瘤組有152種細(xì)菌，健康對(duì)照組有174種細(xì)菌。由圖4可以看出，在屬水平上將兩組進(jìn)行分析，其中不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、庫(kù)特氏菌屬(Kurthia)、乳球菌屬(Lactococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)相對(duì)豐度較高。鏈球菌屬(Streptococcus)在CA組和NO組中豐度均較高，分別占16.59%和7.89%。不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)在CA組和NO組中相對(duì)豐度分別為0.19%和17.24%；梭桿菌屬(Fusobacterium)在CA組和NO組中的相對(duì)豐度分別為0.11%和14.24.；庫(kù)特式菌屬(Kurthia)在CA組和NO組中相對(duì)豐度分別為0.07%和2.95%；乳球菌屬(Lactococcus)在CA組和NO組中的相對(duì)豐度分別為6.46%和6.74%；耐鹽咸海鮮球菌屬(Jeotgalicoccus)在CA組和NO組中的相對(duì)豐度分別為8.64%和1.05%；擬桿菌屬(Bacteroides)在CA組和NO組的相對(duì)豐度分別為0.64%和6.19%(圖4和表3所示)。

2.4.3 基于高級(jí)別肉瘤組和健康對(duì)照組的OUT的Venn圖結(jié)果分析

根據(jù)聚類得到的OTUs分析結(jié)果，分析兩組之間共有、特有的OTUs，繪制成韋恩圖(Venn Graph)[9]。由圖5可以看出，NO的樹鼩腸道菌群OTUs為640種，而CA組樹鼩腸道菌群OTUs為494種，NO組樹鼩腸道菌群物種數(shù)量大于NO組。

圖3 Phylum水平各樣品相對(duì)豐度分布圖Figure 3 Relative abundance distribution of all samples at phylum level

圖4 Genus水平各樣本相豐度分布圖Figure 4 Abundance distribution of the specimen at genus level

表2 高級(jí)別肉瘤組和健康對(duì)照組門水平上各樣本組間差異顯著性檢驗(yàn)

表3 高級(jí)別肉瘤組和健康對(duì)照組屬水平上含量的差異性分析(部分)

注：圖中綠色代表NO組，藍(lán)色代表CA組，沒(méi)有重疊部分的數(shù)字代表各組的特有OTUs個(gè)數(shù)，圓圈和圓圈重疊部分的數(shù)字代表CA組和NO組之間共有的OTUs個(gè)數(shù)。圖5 基于高級(jí)別肉瘤組和健康對(duì)照組的OUT的Venn圖Note. In the figure, green represents NO group, blue represents CA group, the number of unique OTUs of each group with NO overlap, and the number of overlapping circles represents the number of OTUs shared between the CA and NO groups.Figure 5 Venn diagram based on OUT in the high-grade sarcoma group and the healthy control group

2.4.4 腸道菌群LEfSe分析

LEfSe(LDA effect size)分析，是一種用于發(fā)現(xiàn)和解釋高維度數(shù)據(jù)生物標(biāo)識(shí)的分析工具，該算法強(qiáng)調(diào)的是統(tǒng)計(jì)意義和生物相關(guān)性。能夠在組與組之間尋找具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物標(biāo)識(shí)(Biomarker)[9]。在高級(jí)別肉瘤組，乳桿菌屬(Lactobacillus)是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物標(biāo)記物(圖6)。

圖6 高級(jí)別肉瘤組和健康對(duì)照組樹鼩LDA值分布圖Figure 6 Distribution of LDA values in tree shrews in the high-level sarcoma group and the healthy control group

3 討論

在宿主體內(nèi)，腸道內(nèi)所含有的微生物數(shù)量以及種類是最多的，正常情況下腸道微生物可以保護(hù)腸道上皮，減少疾病的發(fā)生[10]。已有研究表明，腸道菌群參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，包括腫瘤、肥胖、脂肪肝、炎癥、糖尿病、心血管疾病等[11]。當(dāng)腸道微生物因飲食改變或者疾病狀態(tài)下而發(fā)生紊亂時(shí)，腸道微生物的種類和數(shù)量都會(huì)發(fā)生改變，從而降低腸道微生物的保護(hù)作用[12]。隨著人類生活質(zhì)量的不斷提高，腫瘤對(duì)人類健康的威脅日漸突出。腫瘤會(huì)因其發(fā)生的器官、部位以及發(fā)展程度不同從而產(chǎn)生不同的臨床表現(xiàn)。腫瘤作為一種與免疫、代謝等與機(jī)體活動(dòng)密切相關(guān)的復(fù)雜疾病，其發(fā)生發(fā)展通常伴隨腸道菌群的紊亂[13]。確定和腫瘤相關(guān)的微生物可以將其研發(fā)為篩選腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的重要方法，從而可以通過(guò)對(duì)腸道菌群的干預(yù)和改變來(lái)治療和預(yù)防腫瘤[1]。

受宿主和外部環(huán)境的影響，非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物腸道菌群在種間和種內(nèi)都存在結(jié)構(gòu)和豐度的差異[14]，本研究的實(shí)驗(yàn)對(duì)象均為樹鼩，統(tǒng)一喂養(yǎng)市售顆粒飼料，生活在同樣的飼養(yǎng)環(huán)境下，排除了種屬、飲食、環(huán)境等因素的影響，主要探討患有高級(jí)別肉瘤對(duì)宿主腸道菌群的影響。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)3例患有高級(jí)別肉瘤的樹鼩和6例健康樹鼩進(jìn)行16S rRNA測(cè)序分析，兩組樣本檢測(cè)覆蓋深度都在97%以上(即測(cè)序深度合理)，從菌群的Alpha多樣性上分析，多樣性指數(shù)Chao1指數(shù)值、ACE指數(shù)值、Shannon指數(shù)值和Simpsaon指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說(shuō)明高級(jí)別肉瘤組和健康對(duì)照組樣本之間物種Alpha多樣性無(wú)顯著性差異。從菌群結(jié)構(gòu)組成方面來(lái)說(shuō)，CA組和NO組樣本腸道微生物的結(jié)構(gòu)差別主要為螺旋體門(Spirochaetes)的豐度上。其在CA組中豐度為0.03%，在NO組中豐度為0.12%，健康對(duì)照組的豐度明顯高于高級(jí)別肉瘤組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

腸道微生物與人類機(jī)體健康和疾病有著極為密切的關(guān)系。本項(xiàng)研究顯示，患有高級(jí)別肉瘤樹鼩腸道菌群中，維持腸道正常功能的菌群豐度略低于健康樹鼩。這可能提示腸道微生物的結(jié)構(gòu)改變與高級(jí)別肉瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。擬桿菌門(Bacteroidetes)在CA組和NO組中相對(duì)豐度分別占0.75%和8.31%，NO組擬桿菌門相對(duì)含量高于CA組，厚壁菌門(Firmicutes)在CA組和NO組分別占77.79%和47.65%，NO組厚壁菌門相對(duì)含量高于CA組，這與孜白旦·阿不來(lái)提等人進(jìn)行的關(guān)于乳腺癌患者腸道菌群高通量測(cè)序初步探索中報(bào)道的結(jié)果相符[15]。已有學(xué)者報(bào)導(dǎo)厚壁菌會(huì)增加CXCL1基因的表達(dá)，而CXCL1可增加結(jié)直腸癌細(xì)胞的存活，并可促進(jìn)腫瘤血管的生成[16]。這可能提示擬桿菌門在腸道微生物中相對(duì)豐度的降低以及厚壁菌門相對(duì)豐度的升高可能與惡性腫瘤之間存在關(guān)聯(lián)。在患有高級(jí)別肉瘤的樹鼩和健康對(duì)照組樣本腸道微生物的結(jié)構(gòu)差別主要為螺旋體門(Spirochaetes)，NO組豐度明顯高于CA組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，螺旋體吸附在腸粘膜可導(dǎo)致微絨毛損害，嚴(yán)重時(shí)螺旋體還會(huì)侵入腸上皮細(xì)胞，腸道螺旋體可能與腸出血和慢性腹瀉有關(guān)[17]。但本研究結(jié)果與以往報(bào)道的螺旋體門的升高可導(dǎo)致腸粘膜損害結(jié)果不一致。由于動(dòng)物個(gè)體差異、行為特點(diǎn)、獨(dú)立個(gè)體間腸道微生物差異也很大，因此，為了更進(jìn)一步證實(shí)結(jié)論，還需要進(jìn)一步加大樣本含量研究。在高級(jí)別肉瘤組中，乳桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌群。另有研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌可以改善糖尿病患者胰島素抵抗，但又會(huì)導(dǎo)致患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)；乳酸桿菌在糖尿病患者腸道菌群中較健康人群豐度明顯升高，提示機(jī)體健康與乳酸桿菌之間存在某種聯(lián)系[18]。

目前為止，研究者僅僅研究了小部分與人類健康和疾病相關(guān)的微生物。腸道菌群的紊亂和失衡都會(huì)誘導(dǎo)腸道炎癥，并釋放相應(yīng)的代謝產(chǎn)物，從而影響著腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展[19]。所以，深入研究促癌菌群是如何抑制腸上皮修復(fù)、腸道菌群如何產(chǎn)生促癌抑癌分子、菌群與機(jī)體之間的信息通路調(diào)控關(guān)系，是將來(lái)對(duì)腫瘤研究的重點(diǎn)[16]。隨著高通量測(cè)序深度的增加、測(cè)序平臺(tái)技術(shù)的改進(jìn)、生物信息學(xué)的發(fā)展、測(cè)序成本的降低，在不久的將來(lái)或許高通量測(cè)序技術(shù)在腫瘤疾病診斷的過(guò)程中將成為一個(gè)重要的環(huán)節(jié)，通過(guò)對(duì)機(jī)體的特定部位微生物組檢測(cè)來(lái)有效評(píng)估個(gè)體的健康和患病情況，從而研發(fā)更有效的腫瘤治療策略，提高人類的生存質(zhì)量[20]。