袁斌 呂美云 劉紫英

摘要：分離純化宜春溫泉泉水中的嗜熱菌并鑒定分析其系統(tǒng)發(fā)育多樣性。將宜春溫泉水在嗜熱菌分離培養(yǎng)基上進行多次分離純化，液體擴大培養(yǎng)，提取DNA、16S rRNA進行PCR擴增，將其序列送往公司檢測，經(jīng)Blast分析和比對，對檢測結果進行系統(tǒng)發(fā)育分析。結果表明，宜春溫泉泉水中分離并鑒定42株中度嗜熱細菌。宜春溫泉菌群系統(tǒng)發(fā)育中，以芽孢桿菌類群為主;其中，解硫胺素芽孢桿菌屬（Aneurinibacillus）和土樣芽孢桿菌屬（Geobacillus）占主導，其次是短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）、無氧芽孢桿菌屬（Anoxybacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）。

關鍵詞：溫泉;嗜熱菌;分子鑒定;系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號： S182? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）05-0199-05

收稿日期：2017-11-06

基金項目：江西省科技廳青年科學基金（編號：20142BA214011）。

通信作者：劉紫英（1979—），女，江西萬年人，碩士，副教授，從事微生物工程技術研究。E-mail：yingziliu2008@163.com。

嗜熱微生物是指生長溫度上限高于50 ℃的微生物，研究嗜熱菌可以探索高溫環(huán)境中微生物的種類和多樣性[1]，更重要的是可以利用和開發(fā)嗜熱菌在耐熱機制、環(huán)境保護、工業(yè)應用、資源開發(fā)等方面應用[2]，使其具有非常重要的意義。

對熱泉中的微生物資源研究國內外已有相關報道[3-5]。我國南部、西部和北部地區(qū)的熱泉中嗜熱微生物等資源已探索[6-8]，根據(jù)廈門溫泉不同于內陸溫泉和深海熱液噴口的特點，楊波等發(fā)現(xiàn)了一些新的嗜熱菌，為探索廈門地區(qū)新的微生物資源提供依據(jù)[9]。遼寧鞍山溫泉的水樣表明，中溫環(huán)境中以中度嗜熱菌芽孢桿菌屬（Bacillus）為主，對其嗜熱酶進行了定性分析[10]。以上研究表明，國內的溫泉中蘊藏著豐富的嗜熱菌，為開發(fā)相關嗜熱酶提供了前景。

宜春溫泉水溫常年維持在68～72 ℃之間，具有獨特的高硒低硫水質，是迄今全球僅有的高硒且低硫的溫泉[11]。泉水中的嗜熱菌更是具有對泉水的凈化和維穩(wěn)作用。嗜熱菌對高溫有著較強適應性，通過對溫泉中嗜熱微生物的分析，能夠充分了解高溫環(huán)境中微生物的多樣性及其功能多樣性，使其具有重大的意義。本試驗將宜春溫泉泉水中嗜熱菌的多樣性進行研究分析，并且對各菌種之間的相關性進行比對。這一分析為了解溫泉中的生態(tài)平衡提供了有力的證據(jù)，同時也為進一步開發(fā)、利用內陸溫泉中的嗜熱微生物提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

樣品來自于江西省宜春市宜春鎮(zhèn)富硒溫泉，宜春富硒溫泉位于115°E、28°N，坐落在江西省明月山風景區(qū)，國家AAAA級風景區(qū)。在溫泉中心及周圍5個樣點取樣，同時檢測溫泉的溫度、pH值等;樣品采集后裝入無菌50 mL離心管中，4 h之內于4 ℃保存運回實驗室，低溫保藏待用。

2個泉水口，分別標記為宜春新井和宜春老井，實測溫度均為60 ℃，pH值為6.0。采樣時間為2014年5月3日：每個溫泉水樣各5管，運抵實驗室后4 ℃密閉保存待用。

1.2 主要試劑與儀器

DNA marker、16S rRNA擴增引物（27F：5′-ATTCCGGTTGATCCTGC-3′;1541R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）、Goldview Ⅱ型核酸染料、Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

主要儀器設備有溫度梯度PCR儀（伯樂）、超低溫冰箱（美菱）、水平凝膠電泳儀（北京六一DYCP-32A）、生化培養(yǎng)箱（LRH-250A）、凝膠成像儀（伯樂）等。

1.3 培養(yǎng)基

根據(jù)樣品溫泉的溫度，選擇TYE培養(yǎng)基作為富集培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為對照。嗜熱菌分離培養(yǎng)基TYE：1.3 g/L（NH4）2SO4、0.28 g/L KH2PO4、0.25 g/L MgSO4·7H2O、0.07 g/L CaCl2·2H2O、1.8 mg/L MnCl2·4H2O、4.5 mg/L Na2B4O7·10H2O，0.05 mg/L CuSO4·2H2O，0.22 mg/L ZnSO4·7H2O，0.01 mg/L CoCl2，0.03 mg/L Na2MoO4·2H2O，5.0 g/L酵母浸膏（yeast extract），4.0 g/L胰蛋白胨（tryptone），1 L超純水，22 g瓊脂粉，pH值為7.2。

1.4 方法

1.4.1 嗜熱菌的分離純化 溫泉水樣品：將從宜春市宜春鎮(zhèn)富硒溫泉中取得的2處水樣，經(jīng)過壓濾處理后，濾膜（0.22）加入到已滅菌的TYE液體培養(yǎng)基中，在溫度為55 ℃條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，于恒溫水浴搖床上培養(yǎng)3 d，至出現(xiàn)混濁;培養(yǎng)液梯度稀釋后涂布TYE平板，55 ℃溫箱培養(yǎng)，待形成明顯菌落后，再依據(jù)形態(tài)菌落特征挑取單菌落。每一個單菌落轉接搖管，在相同條件下將細菌液梯度稀釋，然后采用稀釋涂布平板法分離細菌，重復多次，直到得到單菌落，挑取平板中的單菌落，根據(jù)菌落形態(tài)特征進行編號。宜春溫泉泉水中分離出的菌株，宜春新井編號為N11、N12、N1202、N1209、N9、N1211、N1212、N1213、N1214、N1216、N1221、N22、N1222、N23、N1224、N24、N1230、N1233、N13、N3、N14、N15、N17、N18、N28、N2、N4、N5、N8、N19、N20、N25、N26、N27、N29;宜春老井編號為O2104、O2108、O2111、O2112、O2202、O2203、O2212。

1.4.2 細菌基因組DNA的提取 挑選每個編號的單個菌落，分別接種到液體培養(yǎng)基中，55 ℃恒溫搖床培養(yǎng)10 h，測定D值并檢測菌體濃度后，用細菌基因組DNA的提取用試劑盒提取總DNA。參考試劑盒的操作說明書進行提取DNA。

1.4.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 取待檢測的樣品5 μL與1 μL 10×DNA Loading Buffer均勻混合，瓊脂糖水平凝膠電泳檢測，電泳緩沖液為0.5×TAE，電泳電壓為75 mV。

1.4.4 16S rDNA基因的PCR擴增和產物純化 選擇細菌通用引物上游引物（27F：5′-ATTCCGGTTGATCCTGC-3′），下游引物（1 541R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）;PCR反應體系：12.5 μL 2×Taq PCR Master，上下游引物各 0.5 μL，DNA模板1.5 μL，補足水至25 μL;擴增條件為：94 ℃ 5 min;94 ℃ 60 s，56.4 ℃ 45 s，72 ℃ 100 s，30個循環(huán);72 ℃延伸 10 min。由上海生工生物工程（上海）股份有限公司協(xié)助將本試驗所得的PCR擴增產物純化及測序。

1.4.5 嗜熱菌的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)生關系分析 進入NCBI官網(wǎng)，上傳測序的序列獲取菌株序列號（KY433292～KY433310、KY433860～KY433882），經(jīng)Blast查詢已測序列的同源序列，篩選并下載與其相似度較高的菌株序列并將其作為參考序列，記錄相似序列的GenBank收錄號、與原序列的相似度、分值（分值表示2株菌株相似性的參考值，數(shù)值越大，相似度越高）。用軟件Mega 6.0進行序列分析，Neighbour-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并且在其分枝上標出自展檢驗Bootstrap值（1 000次重復獲得）。

2 結果與分析

2.1 宜春溫泉泉水中嗜熱菌的分離純化

從宜春溫泉泉水中分離純化近150株嗜熱菌，經(jīng)形態(tài)初步鑒定篩選，最后DNA瓊脂凝膠電泳檢測到PCR擴增，有42個編號的菌體測序成功（35個新井、7個老井），所以本研究的最終結果只選取與測序成功的編號相關內容進行分析討論。

2.2 宜春溫泉泉水中嗜熱菌DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測

由圖1可知，嗜熱菌經(jīng)試劑盒提取DNA后電泳顯示了良好的效果，顯示條帶很亮，但也有一些拖尾現(xiàn)象，估計是少量蛋白沒有完全清除干凈，但結果不影響下一步的PCR擴增。

2.3 宜春溫泉泉水中嗜熱菌的PCR擴增

由圖2可知，提取后的DNA經(jīng)過PCR擴增后，每條條帶擴增的大小與marker比較在1 600 bp左右，符合16S rRNA的大小，擴增成功，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

2.4 在NCBI中的Blast結果

分離純化得到42株不同表型的嗜熱細菌菌株，通過Blast比對分析其16S rRNA序列，由表1可知，嗜熱菌歸屬于5個屬11種：土樣芽孢桿菌屬（Geobacillus）的嗜熱脂肪土芽孢桿菌（G. stearothermophiluspartial）、喜熱嗜油地芽胞桿菌（G. thermoleovorans）、土芽孢桿菌（Geobacillus sp.）、嗜熱地芽孢桿菌（G. kaustophilus）;解硫胺素芽孢桿菌屬（Aneurinibacillus）的嗜熱嗜氣解硫胺素芽孢桿菌（A. thermoaerophilus）;短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）的波斯坦短芽孢桿菌（B. borstelensis），嗜熱短芽孢桿菌（B. thermoruber）;芽孢桿菌屬（Bacillus）的地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）、芽孢桿菌（Bacillus sp.）;無氧芽孢桿菌屬（Anoxybacillus）的A. lavithermus、努比鹵地無氧芽孢桿菌（A. rupiensis），其中土樣芽孢桿菌屬（Geobacillus）和解硫胺素芽孢桿菌屬（Aneurinibacillus）是優(yōu)勢屬，均占 23.8%，其次是短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）、無氧芽孢桿菌屬（Anoxybacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）分離最少。從采樣地分析，新井的群落多樣性更豐富，新井中分離有短芽孢桿菌屬、土樣芽孢桿菌屬、芽孢桿菌屬、無氧芽孢桿菌屬、解硫胺素芽孢桿菌屬;老井僅分離到短芽孢桿菌屬、土樣芽孢桿菌屬、芽孢桿菌屬這3個屬;這估計與舊井的過度開放有關，取水過度，造成菌群多樣性豐度小。

2.5 嗜熱菌的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

由表1與圖3可知，從宜春溫泉泉水中能夠分離出一定數(shù)量且不同類群的嗜熱菌，表明嗜熱菌能夠在溫泉這種特殊的環(huán)境中生存，并且廣泛存在。從溫泉泉水中分離得到的這批嗜熱菌中N1202、N1221、O2108、O2202、O2212、N11、N14、N17、N4屬于短芽孢桿菌屬;N1209、N1211、N1212、N1213、N1214、N1216、N1222、N1233、O2104、O2203屬于土樣芽孢桿菌屬;N1224、O2111、O2112、N27、N5屬于芽孢桿菌屬;N1230、N12、N18、N19、N28、N2、N9、N13屬于厭氧芽孢桿菌屬（Anoxybacillus）;N3、N8、N15、N20、N22、N23、N24、N25、N26、N29屬于解硫胺素芽孢桿菌屬（Aneurinibacillus）。

從分析結果可以看出，150株分離純化菌株中獲得42種基因型菌株，宜春溫泉中的嗜熱菌為中度嗜熱細菌，以芽孢桿菌類群為主，具體為土樣芽孢桿菌屬、短芽孢桿菌屬、芽孢桿菌屬、厭氧芽孢桿菌屬、解硫胺素芽孢桿菌屬。其中，優(yōu)勢菌群為土樣芽孢桿菌屬和解硫胺素芽孢桿菌屬，均占23.81%。上述分析結果說明，解硫胺素芽孢桿菌屬和土樣芽孢桿菌屬在宜春溫泉的微生態(tài)系統(tǒng)中處于優(yōu)勢地位。短芽孢桿菌屬占總菌群數(shù)量的21.4%、厭氧芽孢桿菌占19.05%，為次要菌群，芽孢桿菌屬約占總菌株數(shù)的11.90%，為最少的菌群。本研究結果與李楊霞等在四川、陜西溫泉報道菌株主要分布在厭氧芽孢桿菌屬和土樣芽孢桿菌屬有其相似性，都分離有厭氧芽孢桿菌屬和土樣芽孢桿菌屬，且為優(yōu)勢菌[12]。本研究結果與Maugeri等報道土樣芽孢桿菌屬在60 ℃左右的中等高溫條件下一般處于優(yōu)勢地位的報道是一致的，土樣芽孢桿菌屬是中度嗜熱的芽孢桿菌分支屬，廣泛存在各地熱泉中[13]。本研究分離純化得到的嗜熱菌菌株結果是不同于在福建和云南省的國內研究者的報道。郭春雷等對云南溫泉的嗜熱菌報道顯示，在滇西二泉中棲熱菌屬（Thermus）的高溫菌株為優(yōu)勢菌群[14]。綜上結果表明，嗜熱菌的菌群分布與其地理位置有密切關系，不同地域的嗜熱菌優(yōu)勢菌呈現(xiàn)不一。

3 討論與結論

通過可培養(yǎng)法富集分離宜春溫泉泉水中的嗜熱菌，進而分離純化、利用16S rRNA分子鑒定其菌株，分析溫泉中嗜熱菌的系統(tǒng)發(fā)育，在嗜熱微生物分類學中從分子時鐘水平來分析其系統(tǒng)發(fā)育地位并確定宜春溫泉泉水中的優(yōu)勢菌群，且通過這些優(yōu)勢菌群的特性，更好地了解和發(fā)掘溫泉中有益的功能菌，使其發(fā)揮巨大作用。然而，可培養(yǎng)法獲得的嗜熱微生物非常有限，本結果獲得的嗜熱短芽孢桿菌（B. thermoruber）、波斯坦短芽孢桿菌（B. borstelensis）、嗜熱脂肪土芽孢桿菌（G. stearothermophi luspartial）、喜熱嗜油地芽胞桿菌（G. thermoleovorans）、土芽孢桿菌（Geobacillus sp.）、嗜熱地芽孢桿菌（G. kaustophilus）;地衣芽孢桿菌（B. licheniformis），芽孢桿菌（Bacillus sp.）;A. lavithermus、努比鹵地無氧芽孢桿菌（A. rupiensis）、嗜熱嗜氣解硫胺素芽孢桿菌（A. thermoaerophilus）等11種嗜熱菌。這個結果與進一步采用非培養(yǎng)法，利用高通量測序技術檢測宜春泉水中細菌群落結構與多樣性有些差異。高通量測序技術對水體樣品物種類群結果顯示，主要屬于不動桿菌屬（Acinetobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、水棲菌屬（Enhydrobacter）、Thermosynechococcu、鞘脂桿菌屬（Sphingobacterium）和金黃桿菌屬（Chryseobacterium）;這也為以后采用多種培養(yǎng)基分離培養(yǎng)嗜熱菌提供一個思路， 隨著分子生物學技術的推進，嗜熱微生物多樣性探索可以拓展到更多嗜熱菌，同時對嗜熱微生物系統(tǒng)發(fā)育分析提供一個更好的方向。

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