陳怡君++++++郭曉輝++++++高芳雪++++++王愛(ài)華++++++李鋆++++++李外++++++劉萍

[摘要] 目的 對(duì)白花蛇舌草和它的混偽品進(jìn)行分子生物鑒定，保證該藥材的臨床藥效和使用安全。 方法 提取白花蛇舌草及其混偽品的DNA，使用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取ITS2序列的片段，將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，運(yùn)用Condon Code Aligner軟件進(jìn)行校對(duì)拼接，去除低質(zhì)量區(qū)。用HMMer注釋法保留ITS2序列全長(zhǎng)。運(yùn)用MEGA 5.1軟件對(duì)真?zhèn)纹沸蛄羞M(jìn)行分析，計(jì)算真?zhèn)纹返倪z傳距離，構(gòu)建鄰接（NJ）樹(shù)評(píng)估真?zhèn)纹分g的親緣關(guān)系。采用ITS2數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)。 結(jié)果 白花蛇舌草與混偽品的ITS2序列存在明顯差異。 結(jié)論 運(yùn)用ITS2序列能準(zhǔn)確有效鑒別出白花蛇舌草和混淆品。

[關(guān)鍵詞] 白花蛇舌草；混偽品；ITS2；分子鑒定

[中圖分類(lèi)號(hào)] R282.12 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）11（b）-0021-04

[Abstract] Objective To ensure the clinical efficacy and safety of Hedyotis diffusa， identify Hedyotis diffusa and its mix adulterants by molecular biological assay. Methods The polymerase chain reaction （PCR） technique which used DNA templates of Hedyotis diffusa and its mix adulterants and ITS2 sequence primers was performed to obtain the ITS2 regions. The amplification products were sequenced bi-directionally. Sequences were assembled by the CodonCode Aligner. ITS2 sequences of plants were obtained integrally by HMMer annotation method and analyzed by MEGA5.1 to calculate genetic distance among Hedyotis diffusa and its mix adulterants. The neighbor-joining （NJ） phylogenetic tree was constructed to evaluate genetic relationship of plants. ITS2 secondary structures were predicted by ITS2 database. Results There was distinct difference on ITS2 sequences between Hedyotis diffusa and its adulterants. Conclusion ITS2 sequence can be used as a effective marker for identifying Hedyotis diffusa and its adulterants.

[Key words] Hedyotis diffusa； Adulterants； ITS2； Molecular identification

白花蛇舌草為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草（Oldenlandia diffusa）的全草，具有清熱解毒、利尿消腫、活血止痛的功效[1]。由于白花蛇舌草在癌癥的治療中效果確切[2]，需求劇增，使其生藥資源日見(jiàn)貧乏，而出現(xiàn)較多混偽品。常見(jiàn)混偽品傘房花耳草、纖花耳草、松葉耳草等與白花蛇舌草同科屬，僅根據(jù)植物外在特點(diǎn)難以鑒別，經(jīng)常會(huì)被當(dāng)成是白花蛇舌草用于臨床[3-7]。還有商家為了增加利益，摻雜其他不同科屬的漆姑草（石竹科漆姑草屬）、舌雀草（石竹科繁縷屬）在白花蛇舌草中，導(dǎo)致白花蛇舌草的質(zhì)量下降[8-9]。為保證白花蛇舌草的用藥安全和療效確切，它的準(zhǔn)確鑒別是目前一項(xiàng)十分緊迫的任務(wù)。近年來(lái)，DNA條形碼研究在物種鑒定和植物分類(lèi)領(lǐng)域體現(xiàn)出較高的準(zhǔn)確率，成為熱點(diǎn)研究方向[10-11]。此項(xiàng)技術(shù)的核心在于通過(guò)比較一段通用DNA序列，對(duì)物種在基因水平進(jìn)行鑒定和高效識(shí)別，同傳統(tǒng)的顯微鑒別、理化鑒別、色譜鑒別相比較，DNA條形碼技術(shù)重復(fù)性好、穩(wěn)定、快速、準(zhǔn)確，更為重要的是它深入到分子水平，反映了物種的遺傳特性，這種鑒別方式更加可靠[12-13]。有學(xué)者對(duì)多種植物樣本進(jìn)行研究后，提出將DNA條形碼之一的ITS2序列用于植物鑒定的標(biāo)準(zhǔn)序列[14-16]。ITS2因其長(zhǎng)度較短，擴(kuò)增效率高，不同的物種突變位點(diǎn)多，表現(xiàn)出較高的物種分辨率，很適合用于植物鑒定[17-18]。

本研究以白花蛇舌草藥材及纖花耳草、松葉耳草、傘房花耳草、漆姑草、雀舌草等混偽品作為研究對(duì)象獲得ITS2序列，穩(wěn)定、準(zhǔn)確地鑒別白花蛇舌草藥材及其混偽品，為保障該藥材品種的臨床療效提供了新的鑒定技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

植物基因組DNA提取試劑盒（CW0531，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；2×Es Taq MasterMix（康為世紀(jì)生物科技有限公司）；引物（華大基因科技有限公司合成）；VeritiTM96 PCR儀（杭州博日科技有限公司）；電泳儀（DYY-8C，北京白晶生物科技有限公司）；核酸/蛋白質(zhì)凝膠圖像分析管理系統(tǒng)（GSG-2000，中國(guó)珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；DNA分析儀（3730xl，Applied Biosystems）。

1.2 植物材料

材料信息見(jiàn)表1，包括實(shí)驗(yàn)樣品及GenBank下載序列，其中，白花蛇舌草和混偽品實(shí)驗(yàn)樣品采自海南、蘇州、廣東等地，由解放軍總醫(yī)院劉萍主任藥師鑒定，憑證標(biāo)本保存于解放軍總醫(yī)院海南分院藥劑科中藥標(biāo)本室。

1.3 植物DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序

將白花蛇舌草和3種混偽品的干燥植物分別用研缽碾成粉末，各取30 mg置離心管中，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA。收集DNA溶液，-20℃冰箱保存。正向引物為ITS2F：5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'，反向引物為ITS3R：5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'[19]。PCR反應(yīng)體系包括25 μL 2×ES Taq Master Mix，2 μL正向引物ITS2F，2 μL反向引物ITS3R，9 μL超純水，12 μL模板（基因組DNA），體系配制共為50 μL。使用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：Step1：94℃變性5 min；Step2：94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s（進(jìn)行40個(gè)循環(huán)）；Step3：72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在0.7%的瓊脂糖凝膠上電泳跑膠，獲得單一條帶后，將PCR產(chǎn)物送至華大基因貿(mào)易有限公司利用DNA分析儀進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Codon Code Aligner 6.02（Condon Code Co.，USA）對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行校對(duì)拼接，除去序列兩側(cè)低質(zhì)量區(qū)和切除引物。對(duì)GenBank下載的和拼接后得到的ITS2序列用HMMer注釋法切5.8 S和28 S端，保留ITS2的全長(zhǎng)[20]。然后用軟件MEGA 5.1比較序列變異，計(jì)算遺傳距離和構(gòu)建鄰接（NJ）樹(shù)。采用Koetschan等[21]建立的ITS2數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 序列峰圖

白花蛇舌草（憑證標(biāo)本號(hào)BHS15101）的ITS2序列測(cè)序峰見(jiàn)圖1，序列長(zhǎng)度為214 bp，其中質(zhì)量為QV≥20的堿基為214 bp，質(zhì)量較好，沒(méi)有含PolyA（≥5個(gè)單堿基重復(fù)）和PolyT結(jié)構(gòu)，CG含量為65.9%。

2.2 白花蛇舌草種內(nèi)序列比對(duì)

3條白花蛇舌草ITS2序列，比對(duì)后序列長(zhǎng)度均為214 bp，GC含量為65.9%～66.8%，均值為66.37%。有2處單堿基變異，為73位點(diǎn)處T-C變異和173位點(diǎn)處T-G變異，白花蛇舌草種內(nèi)ITS2序列的平均K2P距離為0.0063，最大的K2P距離為0.0094。

2.3 白花蛇舌草與其混淆品序列比對(duì)

本實(shí)驗(yàn)白花蛇舌草與其混淆品共15個(gè)樣品的ITS2序列的長(zhǎng)度范圍為213～223 bp，GC含量范圍為57.7%～69.0%。所有樣品ITS2序列比對(duì)后長(zhǎng)度為251 bp，其中變異位點(diǎn)為131個(gè)，信息位點(diǎn)為107個(gè)。白花蛇舌草種內(nèi)及種間K2P距離見(jiàn)表2。

從表中可以看出白花蛇舌草與同科屬的傘房花耳草、纖花耳草和松葉耳草的種間K2P距離平均值為0.2110，最大K2P距離為0.2784，變異相對(duì)較小，其中白花蛇舌草與纖花耳草的遺傳距離最近，最大K2P距離為0.1453；而白花蛇舌草與不同科屬的混偽品雀舌草和漆姑草種間K2P距離平均值為0.6127，最小K2P距離為0.5506，變異較大。

2.4 白花蛇舌草與其混偽品的鄰接樹(shù)

從構(gòu)建的NJ樹(shù)可以看出，來(lái)自不同序列的白花蛇舌草聚為一支。同一科屬的白花蛇舌草、傘房花耳草、纖花耳草、松葉耳草聚在一起，其中白花蛇舌草與纖花耳草、松葉耳草親緣關(guān)系比較近，與纖花耳草最近，與遺傳距離的計(jì)算結(jié)果相一致，傘房花耳草獨(dú)立為一支。不同科屬的石竹科雀舌草和漆姑草獨(dú)立聚為一支。見(jiàn)圖2。

2.5 ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

白花蛇舌草與其混淆品的二級(jí)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3，可以看出，白花蛇舌草與其5個(gè)混淆品在二級(jí)結(jié)構(gòu)上有明顯的差異。主要差異存在于螺旋Ⅰ和螺旋Ⅲ，還有基部的角度不同。白花蛇舌草二級(jí)結(jié)構(gòu)螺旋Ⅰ區(qū)存在5個(gè)環(huán)，其中間有個(gè)大頸環(huán)。白花蛇舌草二級(jí)結(jié)構(gòu)螺旋Ⅰ區(qū)、Ⅲ區(qū)莖環(huán)數(shù)量、大小和位置與其他混淆品也存在明顯不同。白花蛇舌草二級(jí)結(jié)構(gòu)螺旋Ⅲ和螺旋Ⅳ區(qū)的夾角與傘房花耳草、松葉耳草、漆姑草、雀舌草的夾角也不同?？v觀在這種結(jié)構(gòu)差異上，傘房花耳草、漆姑草、雀舌草比松葉耳草、纖花耳草表現(xiàn)更明顯，這種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近與NJ樹(shù)的結(jié)果一致。說(shuō)明白花蛇舌草與混偽品在ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)上存在差異。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究了正品的白花蛇舌草與外形相似的混淆品傘房花耳草、纖花耳草、松葉耳草、雀舌草、漆姑草在ITS2序列上的差異，結(jié)果顯示這種差異不僅體現(xiàn)在ITS2序列堿基種類(lèi)、數(shù)量上，更體現(xiàn)在ITS2序列科屬差異大小和二級(jí)結(jié)構(gòu)上。

白花蛇舌草的種內(nèi)變異位點(diǎn)和遺傳距離明顯少于種間變異位點(diǎn)和遺傳距離。而在種間遺傳距離中，白花蛇舌草與同科屬混淆品的遺傳距離小于與不同科屬的遺傳距離。同樣在構(gòu)建的NJ樹(shù)中，同科屬的白花蛇舌草、纖花耳草、傘房花耳草、松葉耳草聚在一起，不同科屬的漆姑草、雀舌草獨(dú)立聚為一支。這些結(jié)果表明，利用ITS2序列不僅能成功地將白花蛇舌草與其混偽品區(qū)分開(kāi)，還證明了ITS2序列在同科屬植物間的差異是明顯小于不同科屬植物間差異的。耿超等[22]的建澤瀉鑒定研究中也有類(lèi)似發(fā)現(xiàn)，通過(guò)遺傳距離和構(gòu)建的NJ樹(shù)發(fā)現(xiàn)建澤瀉與澤瀉科澤瀉屬物種距離較近，與澤瀉科其他屬及其混偽品之間遺傳距離較遠(yuǎn)。這些研究進(jìn)一步力證了ITS2序列在物種間突變位點(diǎn)多，表現(xiàn)出較高的分辨率。

本文還進(jìn)行了ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示白花蛇舌草與傘房花耳草、漆姑草、雀舌草ITS2序列結(jié)構(gòu)上的差異比與松葉耳草、纖花耳草結(jié)構(gòu)差異表現(xiàn)更明顯，且這種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近與NJ樹(shù)的結(jié)果一致。說(shuō)明ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)的差異也可成為白花蛇舌草鑒別點(diǎn)之一。雖然高婷等[23]的藤梨根分子鑒定證明了藤梨根與其常見(jiàn)混偽品的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)也存在明顯差異，但未就科屬間的細(xì)致差異進(jìn)行深入探索。

從遺傳距離、構(gòu)建的NJ樹(shù)以及ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，纖花耳草和白花蛇舌草的親緣關(guān)系最近，這就表明白花蛇舌草中很容易摻雜纖花耳草，二者有效成分和功效上的差異還有待研究。

本文對(duì)于ITS2序列能否用于白花蛇舌草鑒定做了細(xì)致精準(zhǔn)的探索，結(jié)果表明ITS2序列在白花蛇舌草和混偽品間種間變異大，分辨率高，因此利用其堿基和結(jié)構(gòu)上的差異能夠快速、準(zhǔn)確鑒別出白花蛇舌草和它的混偽品。ITS2序列在中藥材鑒定中具有很大的應(yīng)用價(jià)值。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 左琳，滿其倩，容蓉，等.白花蛇舌草抗腫瘤有效成分及其機(jī)制最新研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)雜志，2015，42（10）：1963-1964.

[2] 毛宇，徐芳，徐小娟，等.白花蛇舌草抗腫瘤成分及其作用機(jī)理研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2015，42（17）：3128-3132.

[3] 薛運(yùn)浩.全草類(lèi)中藥金錢(qián)草、紫花地丁、白花蛇舌草、藥用青蒿、半枝蓮的正品及其易混品的性狀鑒別[J].中醫(yī)臨床研究，2015，7（26）：40-41.

[4] 陳彩蓮，朱流財(cái).白花蛇舌草與水線草的鑒別及化學(xué)成分的含量測(cè)定[J].湖北中醫(yī)雜志，2011，33（6）：69-71.

[5] 李志俊，王金梅，劉宇琴.白花蛇舌草與常見(jiàn)偽品的鑒別[J].甘肅醫(yī)藥，2012，31（6）：463-465.

[6] 王新鳳，馬傳江，曹廣尚.白花蛇舌草及其混淆品中5種抗腫瘤核苷類(lèi)成分含量測(cè)定[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2016，23（7）：92-94.

[7] 姚志紅，周先強(qiáng)，溫麗榮，等.UPLC 指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的白花蛇舌草真?zhèn)舞b別研究[J].中藥材，2016，39（4）：737-742.

[8] 黃柳娜，賴(lài)茂祥，陳慶淑，等.白花蛇舌草真?zhèn)舞b定研究進(jìn)展[J].廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，15（1）：94-96.

[9] 蘆柏震，侯桂蘭，周佳佳.白花蛇舌草與4種混偽品的辨別[J].中醫(yī)藥學(xué)刊，2006，24（8）：1566-1566.

[10] 辛天怡，雷美艷，宋經(jīng)元.中藥材DNA 條形碼鑒定研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2015，17（2）：170-176，184.

[11] 方輝，張樺，姚正培，等.基于ITS2序列探討不同果翅顏色梭梭的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，52（10）：1822-1827.

[12] 陳士林，姚輝，韓建萍，等.中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則[J].中國(guó)中藥雜志， 2013，38（2）：141-148.

[13] Li X，Yang Y，Henry RJ，et al. Plant DNA barcoding： from gene to genome [J]. Biol Rev Camb Philos Soc，2015，90（1）：157-166.

[14] Chen SL，Yao H，Han JP，et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species [J]. PLoS ONE，2010，5（1）：e8613.

[15] Chen S，Pang X，Song J，et al. A renaissance in herbal medicine identification： from morphology to DNA [J]. Biotechnol Adv，2014，32（7）：1237-1244.

[16] 費(fèi)希同，巨苗苗，林源，等.ITS2序列在植物DNA條形碼鑒定中的應(yīng)用[J].亞熱帶植物科學(xué)，2014，43（4）：339-342.

[17] 羅亞皇，劉杰，高連明，等.DNA條形碼在生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用與展望[J].植物分類(lèi)與資源學(xué)報(bào)，2013，35（6）：761-768.

[18] 陳士林.中國(guó)藥典中藥材DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列[M].北京：科學(xué)出版社，2015：6-14.

[19] 湯歡，向麗，趙莎，等.應(yīng)用DNA條形碼ITS2序列對(duì)市售藥材黃柏的鑒定研究[J].世界科學(xué)技術(shù)中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2016，18（2）：184-190.

[20] Keller A，Schleicher T，Schultz J，et al. 5.8S-28S rRNA interaction and HMM-based ITS2 annotation [J]. Gene，2009，430（1-2）：50-57.

[21] Koetschan C，F(xiàn)rster F，Keller A，et al. The ITS2 Database Ⅲ sequences and structures for phylogeny [J]. Nucleic Acids Res，2010，38（Database issue）：D275-D279.

[22] 耿超，谷巍，吳啟南，等.基于ITS2序列的建澤瀉及其混偽品鑒定研究[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，32（2）：181-185.

[23] 高婷，朱珣之.基于ITS2序列的中藥材藤梨根DNA分子鑒定[J].世界科學(xué)技術(shù)中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2016，18（2）：214-220.