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        徐州四種市售食用菌的分子鑒定

        2017-03-06 11:34:29胡揚(yáng)楠張揚(yáng)蘭慧芳殷婷婷蔣秋改
        農(nóng)業(yè)與技術(shù) 2016年21期
        關(guān)鍵詞:分子鑒定食用菌

        胡揚(yáng)楠 張揚(yáng) 蘭慧芳 殷婷婷 蔣秋改 談思源 曾健康 溫洪宇

        摘 要:本文通過(guò)擴(kuò)增食用菌的ITS序列對(duì)徐州市售雙孢蘑菇、香菇、杏鮑菇和草菇的分類(lèi)學(xué)地位進(jìn)行了研究,將4種食用菌的ITS序列與Eztaxon數(shù)據(jù)庫(kù)中真菌模式菌株數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì),選取親緣關(guān)系最近物種的ITS序列,采用Clustalx 1.8軟件和MEGA5.0軟件構(gòu)建分子發(fā)育樹(shù)。研究結(jié)果為雙孢蘑菇、香菇、杏鮑菇和草菇的ITS序列長(zhǎng)度分別為677bp、672bp、605bp和643bp;4種食用菌與親緣關(guān)系最近物種構(gòu)建的分子發(fā)育樹(shù)表明,雙孢蘑菇與模式菌株Agaricus bisporus(登錄號(hào):AJ133385)序列相似性為100%;香菇與模式菌株Lentinula edodes(登錄號(hào):JQ797414)序列相似性為100%;杏鮑菇與模式菌株P(guān)leurotus ostreatus(登錄號(hào):AB733143)序列相似性為100%;草菇與模式菌株Volvariella volvacea(登錄號(hào):AY636049)序列相似性為99%。初步確定雙孢蘑菇為蘑菇屬的Agaricus bisporus;香菇為香菇屬的Lentinula edodes;杏鮑菇為側(cè)耳屬的Pleurotus ostreatus;草菇為小包腳菇屬的Volvariella volvacea。

        關(guān)鍵詞:食用菌;ITS序列;分子鑒定

        中圖分類(lèi)號(hào):S646 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A DOI:10.11974/nyyjs.20160912001

        我國(guó)食用菌種質(zhì)資源豐富,而傳統(tǒng)食用菌的分類(lèi)鑒定主要是基于菌絲、孢子和子實(shí)體的形態(tài)學(xué)特征和生理生化特征。真菌形態(tài)特征易受到培養(yǎng)條件的影響,許多子實(shí)體類(lèi)型難以獲得,增加了分類(lèi)鑒定的難度。真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer,簡(jiǎn)稱ITS)是位于真菌核糖體RNA上18S和28S基因之間的片段,其兩側(cè)分別是18S RNA基因和28S RNA基因[1],長(zhǎng)度一般為650~750bp。White等于1990年設(shè)計(jì)了ITS1、ITS4、ITS5 3對(duì)可用于大多數(shù)擔(dān)子菌和子囊菌的特異性鑒定引物[2],此后ITS序列分析技術(shù)在真菌分類(lèi)和鑒定的研究中得到廣泛應(yīng)用。如李晶等采用形態(tài)學(xué)鑒定方法與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合將1種野生食用菌鑒定為金山巨菇(Tricholoma sp.)[3],雷瓊等也采用同樣的方法將一種大型食用菌鑒定為硫磺菌(Laetiporus sulphureus)[4]。本研究通過(guò)市售食用菌子實(shí)體的形態(tài)特征進(jìn)行觀察,結(jié)合ITS 序列分析初步確定分類(lèi)學(xué)地位,為食用菌種質(zhì)資源提供了依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 供試材料

        供試雙孢蘑菇、香菇、杏鮑菇和草菇購(gòu)自徐州市銅山新區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),編號(hào)分別為W1、W2、W3和W4。

        1.2 子實(shí)體形態(tài)觀察

        取完整子實(shí)體,觀察并描述菌蓋、菌褶和菌柄等。

        1.3 DNA提取

        將新鮮的子實(shí)體烘干后粉碎成粉末并過(guò)篩,儲(chǔ)存?zhèn)溆?。稱取適量樣品粉末,放入研缽中加入液氮碾磨充分破碎細(xì)胞,將碾磨碎粉轉(zhuǎn)入離心管中,樣品DNA的提取方法參照改進(jìn)的CTAB法[5]進(jìn)行。提取的總DNA 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

        1.4 ITS區(qū)段的PCR擴(kuò)增

        采用通用引物ITS1(5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -

        3')與ITS4(5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3')[2]擴(kuò)增食用菌的ITS序列。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min; 94℃變性40S,55℃退火45S,72℃延伸1min,30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物4℃條件下保存。取5μL產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

        1.5 PCR產(chǎn)物的純化和測(cè)序

        采用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工)從瓊脂糖凝膠電泳中回收DNA。具體步驟參照試劑盒說(shuō)明。經(jīng)膠回收純化后的PCR產(chǎn)物送至南京斯普金生物科技有限公司完成測(cè)序。

        1.6 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

        將測(cè)序所得W1,W2,W3,W4 4種食用菌的ITS序列與Eztaxon數(shù)據(jù)庫(kù)中真菌模式菌株數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì),選取親緣關(guān)系最近物種的ITS序列,采用Clustalx 1.8軟件和MEGA5.0軟件以Neighbor-Joining法構(gòu)建分子發(fā)育樹(shù)[6],重復(fù)取樣1000次[7] 。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 子實(shí)體形態(tài)觀察

        食用菌子實(shí)體形態(tài)見(jiàn)圖1,具體特征如下:

        W1:菌蓋近半球形,白色,光滑;菌肉白色,厚;菌褶褐色至黑褐色,密,窄;菌柄近圓柱形,白色,光滑;具菌環(huán),單層,膜質(zhì)。

        W2:菌蓋扁平,邊緣內(nèi)卷,表面淺褐色至深褐色,邊緣常有毛狀或絮狀鱗片;菌肉白色,稍厚;菌褶白色,密;菌柄中生,白色,彎曲。

        W3:菌蓋圓碟狀,淺褐色;菌褶延生,密集,乳白色;菌柄偏生,中實(shí),棒狀,表面平滑,無(wú)菌環(huán)。

        W4:菌蓋近鐘形,中部稍凸起且色深,邊緣完整;菌褶著生于菌蓋下方,稍密;菌柄著生于菌蓋下方中央,白色稍帶黃色。

        2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

        基于ITS基因序列,對(duì)W1,W2,W3,W4與親緣關(guān)系近的模式菌株進(jìn)行分子發(fā)育學(xué)分析,構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2。結(jié)果表明:W1與模式菌株Agaricus bisporus (登錄號(hào):AJ133385)聚為一支,置信度為100%,ITS序列相似性為100%,初步確定食用菌W1為蘑菇屬的雙孢蘑菇Agaricus bisporus;W2與模式菌株Lentinula edodes(登錄號(hào):JQ797414)聚為一支,置信度為100%,序列相似性為100%,初步確定食用菌W2為香菇屬的Lentinula edodes;W3與模式菌株P(guān)leurotus ostreatus(登錄號(hào):AB733143)聚為一支,置信度為100%,序列相似性為100%,初步確定食用菌W3為側(cè)耳屬的Pleurotus ostreatus;W4與模式菌株Volvariella volvacea(登錄號(hào):AY636049)聚為一支,置信度為100%,序列相似性為99%,初步確定食用菌W4為小包腳菇屬的Volvariella volvacea。

        3 討論

        食用菌具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)值。本文4種食用菌均為徐州市場(chǎng)常見(jiàn)菌類(lèi),且具有種植技術(shù)成熟,菌體產(chǎn)量高等特點(diǎn),有較高的食用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。食用菌采收以后,組織柔嫩,含水量高,后熟作用強(qiáng),容易變質(zhì),不耐貯藏[8],徐州地處江蘇北部,擁有便捷的交通運(yùn)輸業(yè),使得市售食用菌的種類(lèi)眾多,加之徐州食用菌種植歷史悠久,栽培經(jīng)驗(yàn)豐富,發(fā)展優(yōu)勢(shì)明顯[9]。加強(qiáng)食用菌種質(zhì)資源的鑒定和挖掘?qū)τ诎l(fā)展食用菌產(chǎn)業(yè)具有重要意義。

        采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定具有易于觀察和比較優(yōu)勢(shì),但其主要根據(jù)基因的表型進(jìn)行研究,缺乏多態(tài)性指標(biāo),且容易受到多種因素的影響,尤其是地域分隔會(huì)造成食用菌種內(nèi)的形態(tài)多樣性較高的現(xiàn)象,給種和親緣種的鑒定帶來(lái)一定的難度和分歧[3]。本文結(jié)合ITS序列分析對(duì)常見(jiàn)菌進(jìn)行分子鑒定,結(jié)果表明4種食用菌分別是蘑菇屬的雙孢蘑菇(Agaricus bisporus),香菇屬的香菇(Lentinula edodes),側(cè)耳屬的杏鮑菇(Pleurotus ostreatu),小包腳菇屬的草菇(Volvariella volvacea),研究結(jié)果系統(tǒng)完善了徐州市常見(jiàn)食用菌的種質(zhì)資源,為進(jìn)一步篩選優(yōu)種、提高產(chǎn)量、優(yōu)化母種等研究提供了理論基礎(chǔ)。

        參考文獻(xiàn)

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        作者簡(jiǎn)介:胡揚(yáng)楠(1993-),女,大學(xué)本科,研究方向:食用菌種質(zhì)資源;溫洪宇,博士,碩士生導(dǎo)師,研究方向:環(huán)境微生物學(xué)。

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